我国首株噬藻体(蓝藻病毒)的分离与鉴定

分离得到一株裂解织线藻和席藻的噬藻体。对该噬藻体的研究发现:光照条件是感染所必需的,但不依赖于金属离子(如镁离子);裂解织线藻的周期(27℃条件下)为4h,其中潜伏期为3h,最后的1h为裂解期,病毒释放量约200 PFU/细胞,感染过程中,织线藻的放氧速率急剧下降,此外还发现:40℃下处理10min,噬藻体保持100％活性;50℃下处理1min,失活率小于25％;50℃下处理10min,失活率为40％;60℃下处理1min,失活率为85％;60℃下处理10min,失活率大于99％,在电子显微镜下可以观察到此病毒为噬菌体形态,头部直径为52um,尾部很短,几乎不可见,该噬藻体的遗传物质为双链DNA,基因纽约36kb。

蓝藻病毒(噬藻体)的研究进展

蓝藻（Ｂｕｌｅｇｒｅｅｎａｌｇａｅ）是一类原核生物，具有细菌的一些特征，因此又常称为蓝细菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），相应地，把感染蓝细菌的病毒称为噬藻体（Ｃｙａｎｏｐｈａｇｅ）［１～２］，这是由于噬藻体与噬菌体非常相似的缘故。除蓝藻外，所有...

蓝藻抗病毒蛋白N基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

目的:构建蓝藻抗病毒蛋白(CV-N)基因原核表达载体,表达、纯化并复性其重组蛋白。方法:根据GenBank中CV-N的全基因序列,人工合成CV-N序列,进行PCR扩增。将扩增的PCR产物克隆至原核表达载体pET30a(+)上,构建重组表达载体pET30a-CV-N,测序鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达蛋白,SDS-PAGE和Westenblot鉴定表达产物,Ni Sepharose柱纯化目的蛋白,稀释法复性蛋白。结果:重组质粒pET30a-CV-N测序结果显示,插入片段为303 bp,与GenBank中的CV-N基因序列完全相同。经IPTG诱导的CV-N基因可在E.coli中高效表达;SDS-PAGE分析表明,相对分子质量11000处出现一条新条带,主要以包涵体形式存在,37℃诱导2、4、6、8 h后,表达蛋白分别占菌体蛋白的3.87%、19.10%、33.98%和31.58%。Western blot结果显示,重组蛋白能与抗His单抗特异性反应。将诱导6 h的菌体超声破碎后,Ni Sepharose柱纯化,相对分子质量11 000处显示出清晰的单一条带,且蛋白复性效果良好。结论:成功地构建了CV-N原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白,为深入研究其抗病毒的活性奠定了基础。

抗人类免疫缺陷病毒蓝藻蛋白-N研究进展

蓝藻抗病毒蛋白 N (cyanovirin N ,CV N )是一种从椭孢念珠藻 (Nostocelliposporum )中分离出的抗病毒活性蛋白 ,能够有效地抑制多个亚型的人类免疫缺陷病毒Ⅰ (HIV Ⅰ ) ,Ⅱ (HIV Ⅱ )以及猴免疫缺陷病毒 (SIV )。CV N的上述特性使它可能成为艾滋病 (AIDS)的潜在高效治疗药物。大量研究证明 ,CV N与包膜糖蛋白 12 0 (GP12 0 )具有高度亲和性并能够阻断由包膜蛋白介导的细胞融合过程从而阻止病毒的扩散。CV

重组蓝藻抗病毒蛋白N的纯化复性及其抗单纯疱疹病毒1型活性的研究

目的纯化复性重组蓝藻抗病毒蛋白N(cyanovirin-N,CV-N)并研究其抗病毒活性。方法将诱导表达的重组CV-N经Ni Sepharose柱纯化并以稀释法复性,在Vero细胞中进行CV-N抗单纯疱疹病毒1型(herpes si mplex virus type1,HSV-1)活性的研究。通过观察细胞病变效应(CPE)及MTT比色法检测细胞活性,以判断CV-N的抗病毒效应。结果重组CV-N经Ni Sepharose柱纯化后,SDS-PAGE显示11KDa处清晰的单一条带,复性的重组CV-N对Vero细胞毒性极低,对HSV-1无直接灭活作用,CV-N对病毒的吸附及生物合成均有抑制作用,且强于阳性对照药物阿昔洛韦。结论经纯化复性的CV-N具有良好的抗HSV-1活性,值得进一步研究和开发。

蓝藻抗病毒蛋白N的研究进展

蓝藻抗病毒蛋白N(Cyanovirin-N)简称CV-N,相对分子质量11kD,含有101个氨基酸残基,主要是由β-叠片结构形成的链状蛋白,其中有2个内部二硫键。通过基因重组表达纯化的产物,其结构和活性均与天然CV-N相同。CV-N与人类免疫缺陷病毒(HIV)包膜糖蛋白120(gp120)具有高度亲和性,并能够阻断由包膜蛋白介导的细胞融合过程从而阻止病毒的扩散。CV-N不仅能够有效地抑制多个亚型的人类免疫缺陷病毒1(HIV-1),2(HIV-2),猴免疫缺陷病毒(SIV),而且对单纯疱疹病毒、流行性感冒病毒及其他一些包膜病毒也有抑制作用。CV-N的若干特性使其有可能成为一种非常有价值的新型抗病毒药物。

重组蓝藻抗病毒蛋白N抗柯萨奇B3病毒的体外实验研究

目的:研究重组蓝藻抗病毒蛋白N(CV-N)体外抗柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的作用。方法:通过观察药物毒性、细胞病变效应(CPE)、MTT比色法检测细胞增殖,判断CV-N的细胞毒性及抗病毒效果。结果:CV-N对Vero细胞毒性较低(TC50为359μg/ml),对CVB3无直接灭活作用,对阻止CVB3病毒吸附细胞的作用优于病毒唑,而对病毒的复制无明显抑制作用。结论:CV-N作用于CVB3病毒感染的早期,有可能作为柯萨奇病毒感染的预防药物。

蓝藻抗病毒蛋白N

蓝藻抗病毒蛋白N(cyanovirin N)是Boyd等 1997年在蓝藻中发现的一种抗病毒蛋白 ,其抗病毒机制是与病毒表面衣壳蛋白上的甘露寡糖结合 ,阻止病毒与宿主细胞表面的受体结合。由于近年不断发现它对各种严重的RNA逆转录病毒的抗病毒活性而倍受关注。

蓝藻抗病毒蛋白-N在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备

目的:构建抗病毒蓝藻蛋白-N(Cyanovirin-N,CV-N)表达载体并在大肠杆菌中稳定表达,并进一步制备用于检测转CV-N基因表达产物的特异抗体。方法:以已构建的pMD(CV-N)为模板,设计引物,利用PCR技术扩增出CV-N基因,将成熟CV-N的编码框序列构建到原核表达载体pET-His中,氨苄青霉素平板筛选及PCR、酶切鉴定,挑选出阳性克隆进行扩增,DNA测序正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE以及MALDI-TOF/MS分析鉴定,采用透析法重折叠复性,亲和层析分离纯化得到分子量为12700的带有组氨酸标签的重组CV-N融合蛋白。用亲和层析分离纯化后的CV-N融合蛋白作为抗原,采用皮下多点注射免疫的方法免疫昆明小鼠,经过31天的免疫,获得抗CV-N的多克隆抗体。结果:成功地获得了CV-N基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,表达量高达42.0%。用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,测得抗体效价超过1∶8000,Westernblot检测结果显示,该抗体能特异性地与CV-N抗原产生明显免疫亲和反应。结论:建立原核高效稳定表达CV-N系统,获得具有生物学活性的CV-N蛋白,所制备的抗体具有很好的灵敏性和特异性,为进一步研究其功能奠定基础。

重组蓝藻抗病毒蛋白N抗单纯疱疹病毒2型作用的实验研究

目的研究重组蓝藻抗病毒蛋白N(CV-N)并探讨其抗单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的作用。方法以不同剂量的CV-N分别作用于HSV-2病毒复制的各个环节,通过观察药物毒性、细胞病变效应(CPE)、MTT比色法检测细胞增殖。判断CV-N的抗病毒效果。结果重组CV-N对Vero细胞毒性较低,对HSV-2无直接灭活作用,可干扰病毒向宿主细胞的吸附,其抗病毒生物合成的活性优于阳性对照药物阿昔洛韦。结论重组CV-N在体外具有良好的抗HSV-2病毒作用。

蓝藻抗病毒蛋白N全长基因原核表达克隆的构建

目的构建蓝藻抗病毒蛋白（CV-N）全长基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法根据GeneBank中CV-N的全基因序列，人工合成CV-N序列，进行PCR扩增。将扩增的PCR产物经双酶切后，克隆到原核表达载体pET30a（＋）上，构建重组表达载体pET30a—CV-N。重组质粒经核苷酸测序鉴定后，转化宿主茵BL21（DE3）诱导表达目的蛋白。结果CV-N基因可在大肠杆菌中高效表达，重组蛋白相对分子质量为11Kd，以包涵体形式存在。结论成功地构建了CV—N原核表达载体，为CV—N的纯化及其抗病毒的活性研究奠定了基础。

蓝藻抗病毒蛋白-N衍生物的克隆、发酵与纯化

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)能特异性与病毒表面糖蛋白结合,抑制病毒进入宿主细胞及抑制病毒感染细胞与未感染细胞的融合。通过分子设计及优化,在CVN的N-末端连接了5个氨基酸的柔性多肽(GGGGS),构建了SUMO-L5-CVN融合表达系统。SUMO-L5-CVN在大肠杆菌BL21中呈可溶性表达;通过表达条件优化,以0.5 mmol/L IPTG在20℃诱导24 h是最佳的诱导表达条件;SUMO-L5-CVN表达量占菌体总蛋白的30%;经Ni-NTA亲和层析获得融合蛋白SUMO-L5-CVN,SUMO蛋白酶酶切,以及进一步从Ni-NTA亲和层析获得的目的蛋白L5-CVN蛋白纯度>98%。结果表明,低浓度的L5-CVN与流感病毒表面糖蛋白gp120就有较高的亲和力。

蓝藻抗病毒蛋白N衍生物的细胞毒性及抗病毒活性检测

[目的]研究蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)衍生物(LCVN)对永生化上皮角质形成细胞(HaCaT)的毒性及LCVN凝胶的制备和体外活性检测。[方法]用MTT法测定LCVN对HaCaT细胞株的半数毒性浓度(CC50)以及LCVN对流感病毒毒株A/HK/8/68(H3N2)的半数抑制浓度(IC50);用流式细胞检测法检测LCVN对HaCaT细胞周期与细胞凋亡的影响;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测LCVN凝胶与HIV包膜蛋白GP120的相互作用。[结果]培养24和48 h后,LCVN对HaCaT的CC50分别为(9.25±1.21)与(1.94±0.12)μmol/L,将LCVN做成凝胶后,与HIV外膜蛋白GP120的结合在一定浓度范围内具有剂量关系,LCVN凝胶对A/HK/8/68(H3N2)毒株的IC50为(98.20±0.03)nmol/L。[结论]LCVN对HaCaT细胞的毒性明显小于CVN,当做成凝胶以后LCVN对流感病毒A/HK/8/68(H3N2)具明显抑制作用,并能与HIV包膜蛋白GP120相互作用。

蓝藻抗病毒蛋白-N及其基因工程研究进展

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CV-N)具有独特的广谱高效抗病毒活性,特别是因其能有效抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)而备受关注。综述了蓝藻抗病毒蛋白-N的结构、理化性质。

水华蓝藻噬藻体对不同条件培养的宿主细胞感染性分析

在从武汉东湖水样中培养分离水华蓝藻噬藻体(Planktothrix agardhii Virus from Lake Donghu,PaV-LD)的基础上,对在不同条件培养的宿主蓝藻细胞中,PaV-LD增殖效率及裂解作用进行了测定分析。分别将PaV-LD接种到生长期、半连续培养更新率或光照不同的宿主蓝藻液中,并采用稀释培养计数(Mostprobable number,MPN)方法与电镜观察,测定子代PaV-LD释放量及宿主细胞的裂解作用。结果显示:对数生长期宿主蓝藻单个细胞中子代PaV-LD的平均释放量为350感染单位(Infectious Units,IU/cell),显著高于稳定生长期的平均释放量110 IU/cell。在用新鲜培养基更新率为0%、35%、50%和65%的半连续培养宿主蓝藻中,接种PaV-LD 5d之后,噬藻体的释放量分别约为50 IU/cell、70 IU/cell、220 IU/cell或310 IU/cell,表明子代PaV-LD释放率随培养基更新率的增加而显著提高。在光照条件下感染3—4d后,宿主蓝藻细胞充分裂解,并释放大量子代PaV-LD,滴度可由初始7.00×103IU/mL快速增加到8.56×107IU/mL;但在遮光条件下,同样感染的蓝藻细胞未见裂解,也检测不到释放的子代噬藻体。电镜观察显示,在光照条件下感染的蓝藻细胞类囊体膜结构消失,而大量子代PaV-LD颗粒主要分布在原有类囊体的部位。显然,宿主蓝藻细胞的培养条件和状态可能对获得噬藻体纯培养有决定性影响。

EB和CVN抗病毒肽对PRRSV入侵细胞的抵抗作用

为了研究EB抗病毒肽和蓝藻抗病毒蛋白-N(CVN)抗病毒肽抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的入侵作用,对分别转染了不同载体(未转染组、pcDNA3.1空载体组、pcDNA3.1-MSTNpro组、pcDNA3.1-MSTNpro-EB组和pcDNA3.1-MSTNpro-CVN组)的猴肾细胞(Marc-145细胞)进行PRRSV处理,检测病毒核衣壳N蛋白与细胞波形蛋白的mRNA表达差异。结果表明:在PRRSV处理后,与pcDNA3.1-MSTNpro组相比,pcDNA3.1-MSTNpro-EB组和pcDNA3.1-MSTNpro-CVN组中病毒核衣壳N蛋白和细胞波形蛋白的mRNA相对表达量极显著或显著降低(P<0.01或P<0.05)。说明EB抗病毒肽和CVN抗病毒肽具有抗PRRSV入侵细胞的作用。

蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆、表达、纯化及活性鉴定

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)具有强效抗HIV及其他包膜病毒活性,该蛋白序列特殊,难以重组制备,在大肠杆菌细胞质中形成包涵体。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化,通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长DNA序列,构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。通过对诱导剂浓度和诱导时间的优化,发现以0.5mmol/LIPTG在20℃诱导24h可获得最高表达,SDS-PAGE结果显示,SUMO-CVN为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的28%;经特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切及两步Ni-NTA凝胶亲和层析可以得到纯度较高的重组CVN蛋白。ELISA结果表明,重组蛋白CVN与gp120蛋白有较高的亲和力。体外抗病毒活性实验表明,重组蛋白CVN在纳摩尔浓度具有很好的抗HSV-1和HIV-1/ⅢB活性;这为开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。

CVNH结构域的进化分析和选择压力检测

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CV-N)具有广谱抗病毒活性,其同源物构成CVNH(Cyanovirin-N homology)蛋白家族,并且家族成员的抗人类免疫缺陷病毒结构域在进化上非常保守。文章通过重建基因树对CVNH结构域的"零散分布"特点作了更为细致的了解,发现在黑曲霉、费氏曲菌、产黄青霉、粗糙脉孢霉、蓝杆藻和水蕨等物种中存在多份该结构域拷贝。在此基础上,分别采用机理式模型(Mechanistic model)和MEC模型(Mechanistic-empirical combination model)对CVNH结构域序列位点进行适应性进化分析,结果显示:1)两类模型均未检测到统计上显著的正选择位点;2)净化选择对CVNH起主导作用;3)MEC模型更适合所研究的数据。进一步使用"支-特异"模型和"支-位点"模型对蓝杆菌菌株7822和7424的祖先分支进行检测,发现该分支经历过适应性进化,并且鉴定出6个正选择位点(34L、63L、13H、76C、78K和80I)。

米曲霉中蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆与表达

[目的]提高蓝藻抗病毒蛋白-N(CVN)的异源表达量,获得大量高纯度可溶性蛋白。[方法]采用RT-PCR从酱油发酵酱醪宏基因组中克隆获得CVN基因cvn-SF,构建了重组表达载体p ET32a-cvn-SF,转化E.coli BL21菌株,获得工程菌株,优化表达条件,通过Ni-NTA凝胶亲和层析对CVN-SF蛋白进行纯化。[结果]工程菌株在温度30℃、添加1 mmol/L的IPTG诱导剂、培养时间12 h的条件下获得最高表达量的可溶性蛋白。Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到了230.8 mg/L的CVN蛋白,占提取总蛋白含量的33.37%。[结论]所得CVN蛋白高于目前报道的CVN在大肠杆菌的最高表达量140 mg/L^([11])。