蔗果三糖标准样品的研制

根据GB/T15000-2008《标准样品工作导则》的要求,建立蔗果三糖标准样品的研制方法。采用P-2凝胶色谱法结合制备高效液相色谱法从低聚果糖产品中制备得到蔗果三糖,然后通过红外光谱、质谱、核磁共振谱(1HNMR、13CNMR、HMBC、NMQC、COSY)对样品的结构进行鉴定并对核磁信号进行归属。将样品分装成130瓶后,采用高效液相-蒸发光散射法进行均匀性和稳定性检验,通过对8家具有资质的实验室联合测定结果的数据分析,评定出定值结果和不确定度。结果表明:蔗果三糖标准样品的稳定性和均匀性良好,定值结果为99.87%,置信度为95%的不确定度是0.36%。研制出的蔗果三糖标准样品符合国家标准样品研制工作导则的技术要求,可用于有关蔗果三糖和低聚果糖产品的检测和质量控制。

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法测定蔬菜及食品中的1-蔗果三糖和蔗果四糖

目的应用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器联用（HPAEC-PAD）技术，建立蔬菜、食品中低聚果糖（蔗果三糖和蔗果四糖）检测方法。方法以NaOH和乙酸钠为淋洗液梯度淋洗，在CarboPac PAl色谱柱上阴离子交换分离了蔗果三糖和蔗果四糖，用脉冲安培检测器（金电极）进行了检测。结果二者的线性范围分别为1．22～15．20μg／g和1．64～18．30μg／g，检出限分别为0．085μg／g和0．089μg／g。对浓度为6．08和7．32μg／g的蔗果三糖和蔗果四糖混合标准连续进样，其相对标准偏差（RSD）分别为2.80％和1．28％（n=6）。应用本方法分析了菊苣、朝鲜蓟和通力爽口服液等蔬菜和食品中蔗果三糖和蔗果四糖的含量。蔗果三糖和蔗果四糖含量最高的蔬菜组织为菊苣根，分别为6．61g／100g干重和6．51g／100g干重。低聚果糖粉中蔗果三糖和蔗果四糖含量最高，分别为34．13g／100g和32．12g／100g。样品加标回收率蔗果三糖和蔗果四糖分别为93．97％和97．14％。结论该方法简单、方便、灵敏度高，适于蔬菜及食品中蔗果三糖和蔗果四糖的测定。

离子液体中米曲霉果糖基转移酶催化合成蔗果三糖的研究

对来自于米曲霉的果糖基转移酶在离子液体中催化蔗糖反应生成蔗果三糖的过程进行了研究。考察了盐平衡、底物蔗糖和酶量的比率、温度、时间、pH、离子液体和酶量的比率对催化得率的影响,其中离子液体的水活度采用盐的高水合物和低水合物组成的水合盐进行控制。结果表明,最优的催化反应条件为:反应温度40℃,pH6.2,底物浓度60%,反应时间24h。关于离子液体与酶的重复利用方面,离子液体性质和酶的催化活力有待于进一步研究。

在反应系统中影响蔗果三糖形成的因素

研究结果表明 ,酶反应的最适条件为 :初始 p H 6 .0 ;反应温度 50℃、时间 1h;初始蔗糖浓度2 5%。在酶反应过程中添加果糖会促进蔗果三糖的生成 ,其最佳添加时间为反应进行了 30分钟 ,最佳添加浓度为 15% ,可使蔗果三糖的产量提高 50 %。酶的热稳定性随处理温度的提高下降。

HPLC-RID法测定不同批次刺糖中蔗果三糖含量

目的建立测定刺糖中蔗果三糖(GF_2)含量的高效液相色谱-示差折光检测法(HPLC-RID),测定10个不同批次刺糖中GF_2的含量。方法采用YMC-Pack NH_2色谱柱(250mm×4.6mmL.D.,S-5μm,12nm)分离;流动相:乙腈-水=75∶25,流速:1.0mL/min,进样量:30μL。结果 GF_2在0.808~1.616mg/mL浓度范围内线性关系良好,r=0.999 4;精密度相对标准差为0.57%;低、中、高浓度加样回收率分别为97.8%、96.1%、104.3%,相对标准差分别为1.8%、1.8%、1.6%。10批次刺糖中GF_2的含量最高为454.57mg/g,最低为115.90mg/g。结论该方法精密度、准确度良好,适用刺糖中GF_2的定性及定量分析。

双波长薄层色谱扫描法测定刺糖中蔗果三糖的含量

目的建立双波长薄层色谱扫描法测定不同时间、产地刺糖中蔗果三糖（GF2）含量。方法以GF2为标准品,采用双波长薄层扫描分析,展开剂为冰乙酸-三氯甲烷-95%乙醇（9∶11∶11）,显色剂为二苯胺-苯胺-丙酮-磷酸（1∶1∶50∶5）,最大吸收波长510nm,参比波长610nm。结果蔗果三糖（GF2）在0.642 8～15.975 2μg范围内线性关系良好,r=0.999 2,平均回收率为102.5%,RSD为1.55%。不同产地刺糖中GF2含量为在12.957 3～36.328 1mg/g。结论双波长薄层色谱扫描法分离效果好,操作简便,可用于刺糖中GF2的定性及定量分析。

HPLC法测定奶粉中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的含量

目的 采用HPLC法建立同时测定奶粉中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的方法.方法 色谱柱Aglient NH2柱（250mm×4.6mm,5μm）,流动相为乙腈-水（70：30）,示差折光检测器.结果 蔗果三糖浓度在0.3050～6.100mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,r为0.9999;蔗果四糖浓度在0.4054～8.108mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,r为0.9999;蔗果五糖浓度在0.2457～4.914mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,r为0.9996;蔗果三糖加样回收率的平均值为96.1%,RSD=1.5%;蔗果四糖加样回收率的平均值为100.3%,RSD=2.9%;蔗果五糖加样回收率的平均值为100.0%,RSD=3.3%.结论 本方法简便、准确可靠,适用于奶粉中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖三个主要有效成分的测定.

HPLC-RID法测定不同批次刺糖中蔗果三糖含量

HPLC-RID检测法又称成高效液相色谱-示差折光检测法,其检测方法本质上依旧是高效液相色谱检测法,不过检测仪器由常用的紫外检测器换成了示差折光检测器。这种检测器的工作原理是通过比较折光率的变化来检测流动相中的样品峰,具有高度的灵敏性和稳定性,因此多被应用于食品和医药行业。本文研究的目的是通过高效液相色谱示差折光检测法来测定不同批次的刺糖中蔗果三糖的含量。

蔗果三糖及低聚果糖对T细胞分泌干扰素γ的调节作用

目的研究蔗果三糖及低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)对T细胞分泌干扰素(interferon-,IFN-γ^(+))的调节作用。方法从外周血单个核细胞分离培养T细胞。在培养基中添加5mg/mL的蔗果三糖或FOS并检测T细胞的诱导分化。平行设置空白对照。经过3d的原代培养或6d的原代及传代培养,采用流式细胞术检测IFN-γ^(+)T细胞的比例,酶联免疫吸附法测定细胞培养液的IFN-γ^(+)浓度。结果经过3d的原代培养,蔗果三糖组IFN-γ^(+)T细胞比例(47.8100%±4.8800%)显著高于FOS组(36.9600%±4.5800%,P=0.0002)或空白对照组(31.4000%±3.8900%,P=0.0001),蔗果三糖组细胞培养液的IFN-γ^(+)浓度(848.5100 ng/mL±269.0000ng/mL)也显著高于FOS组(357.8700ng/mL±87.3000ng/mL,P=0.0040)或空白对照组(283.5100ng/mL±76.0300ng/mL,P=0.0001);而且,经过6d的原代及传代培养,无论传代之后是否添加蔗果三糖与FOS,蔗果三糖组IFN-γ^(+)T细胞比例(32.0600%±5.2600%;31.7900%±4.8600%)始终显著高于FOS组(22.1300%±4.5400%,P=0.0078;21.8900%±4.4800%,P=0.0086)或空白对照组(18.6500%±2.6900%,P=0.0071;17.8300%±3.1300%,P=0.0074)。结论蔗果三糖有助于T细胞分化并促进T细胞分泌IFN-γ^(+)。

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征

【目的】研究大蒜(Allium sativum L.)中蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征,为大蒜保鲜、加工和品质改良提供依据。【方法】采用饱和度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的硫酸铵分级沉淀1-SST,以确定其所在的硫酸铵部位。分别取1-SST活力最高的硫酸铵部分与底物蔗糖反应,研究其在不同的温度、p H、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖的能力,即采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD),测定1-SST反应前后的1-蔗果三糖的含量,进而计算出1-SST活力大小并总结出其在不同的温度、p H、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖反应的规律;采用的色谱柱为Prevail Carbohydrate ES柱(250 mm×4.6 mm,5μm),色谱柱柱温箱温度为40℃,流动相最大限压20 MP,流动相为乙腈和水,其流速为1.0 m L·min-1,ELSD撞击器关闭状态,漂移管温度90℃,载气流量2.5 L·min-1(空气)。其梯度洗脱方式为:0 min,75%乙腈﹕25%水;15 min,65%乙腈﹕35%水;30 min,50%乙腈﹕50%水;35 min,75%乙腈﹕25%水;40 min,75%乙腈﹕25%水。【结果】在上述测定条件下,果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖6种糖完全分离,出峰时间仅为20 min,测定方法可靠、灵敏度高,满足了测定1-SST活性的要求。以50%(w/w)蔗糖为底物时,仅产生1-蔗果三糖,无其它高果聚糖的产生,证实了在所试条件下,大蒜中1-SST反应具有专一性。大蒜1-SST主要存在于30%—40%硫酸铵饱和度部分,其中0—30%,40%—70%有轻微活力,未发现70%—100%硫酸铵组分有1-SST的活力。取30%—40%的硫酸铵饱和度部分作为样品研究1-SST酶学特征发现其最适反应温度为35℃,当温度到达40℃以上时,酶的活力下降的很快,说明1-SST具有热不稳定性,因此在研究大蒜1-SST时,要尽量避免高温,以免影响后续研究;其最适反应p H为5.0,与大麦(Hordeum vulgare)、菊苣(Cichorium intybus L.)、菊芋(Helianthus tuberosus Colombia)、黑麦草(Lolium rigidum)、龙舌兰(Agave americana L.)的1-SST最适p H大致相同,显示不同植物1-SST活力中心部位的结构可能基本一致;在蔗糖浓度为100—600 mg·m L-1内,酶活力随着底物质量浓度的增加而提高,而当底物浓度超过500 mg·m L-1时,酶活力增加的幅度减少而趋于平缓,这完全符合米氏方程(Michaelis-menten)的酶动力学性质;对于Na+、Cl-来说,离子强度越低,1-SST活力越强,1-SST在35℃下的米氏常数Km为104mmol·L-1。【结论】大蒜1-SST随温度、p H、离子强度、底物质量浓度等变化,不仅影响大蒜贮藏过程中的果聚糖代谢,也影响大蒜加工产品,尤其是大蒜提取物中糖的种类和含量。

聚丙烯酰胺凝胶柱分离制备低聚果糖单组分

利用聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P-2)柱分离高纯度低聚果糖制备单一组分,结果表明,在1.6 cm×100 cm的玻璃柱上最佳的层析条件是洗脱速度0.2 mL/min、上样量0.5 mL(样液质量浓度0.4 g/mL)、柱温40℃。以Megazlaae公司的标准品为对照,经HPLC和MS分析,证明层析分离所得组分峰4、峰3和峰2分别是蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。而且经HPLC面积归一化法定量分析,证明分离产品蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖蔗和果六糖的含量分别为99.91%、99.94%、99.33%和97.89%,表明其纯度很高,可以作为低聚果糖定量分析的标准品使用。

低聚果糖的检测及其生产菌株的筛选

用纸色谱分离法进行低聚果糖的定性、定量分析，用碳柱进行产物的纯化分离，从土壤中筛选出一株能高产低聚果糖的菌株６．２２２，此菌属于霉菌。得出其最佳发酵条件为：初始ｐＨ６．０，温度３０℃，时间２５ｈ。

天然活性成分──低聚果糖的应用前景

低聚果糖又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖 ,是一种存在于水果、蔬菜、谷物等物质中的天然活性成分。它不被小肠消化吸收而直接进入后段肠道内优先为双歧杆菌所利用 ,是双歧杆菌的增殖因子。此外 ,低聚果糖也可抑制植酸与矿物质结合 ,促进矿物质的吸收利用 ,维持体内的矿物质平衡。近年来 ,随着研究的不断深入 ,发现低聚果糖在改善肠道微生物区系、促进动物肠道发育、降低血脂、促进矿物质吸收、提高饲料转化效率、增强免疫力等方面均有很好的功效 ,是一种很有开发前景的功能性低聚糖。

微生物酶法生产果糖低聚糖

介绍了一种简便易行的制备蔗果三糖标准品的方法。研究得出曲霉６．２２２胞内、胞外酶均具有活性，最佳酶反应条件为：ｐＨ６．０，温度５０℃，时间６０ｍｉｎ。最佳初始蔗糖浓度为２５０ｇ／Ｌ。由曲霉６．２２２发酵制备的酶溶液稳定性良好。

大蒜果聚糖∶果聚糖1-果糖基转移酶的酶学特性

大蒜中主要干物质为多糖,其中主要糖类为果聚糖,具有多种保健作用。本文研究了大蒜中果聚糖∶果聚糖1-果糖基转移酶(Fructan∶fructan 1-fructosyltransferase,1-FFT)的酶学特性,为阐明大蒜在采后贮藏、保鲜及深加工过程中果聚糖含量的变化提供依据。结果表明:当以1-蔗果三糖为底物时,1-FFT仅催化生成蔗果四糖,且无其它结构的四糖生成;大蒜1-FFT主要存在于40%~50%硫酸铵部分;其最适p H为6.0,在p H 5.5~6.5条件下1 h内保持稳定;最适温度为25℃,在15~25℃条件下1 h内可保持稳定;低浓度Mn^(2+)、Mg^(2+)、Fe^(3+)促进1-FFT活力,Cu^(2+)、Zn^(2+)、Ag^+抑制1-FFT活力;1-FFT活力随底物浓度升高而增大,其米氏常数Km=0.6977 mol/L,最大反应速率Vmax=116.23μg/h。大蒜1-FFT活力受p H、温度、不同金属离子及底物浓度影响,调节以上因素有助于调控大蒜果聚糖代谢、保持大蒜品质及延长大蒜贮藏期。

低聚果糖国家标准样品发布

2015年4月1日,由全国标准样品技术委员会组织、量子高科（中国）生物股份有限公司承担研制的“益生元标准体系构建——低聚果糖国家标准样品”发布会在上海隆重举行。低聚果糖作为营养强化剂主要应用于食品和保健食品领域。低聚果糖由于结构复杂,一直以来缺乏全球统一的检测方法。此次发布的断蔗果三糖、异蔗果三糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖六项高纯度国家标准样品，填补了国内外实物标准多项空白，将有助于破解对低聚果糖硷测的难题，形成规范的、统一的、直接的低蹩果糖检测方法，进一步推动低聚果糖的推广和应用。

蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的表面展示及酶学性质分析(英文)

【目的】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶催化1分子蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上,形成1-蔗果三糖和葡萄糖。在低聚果糖中,1-蔗果三糖益生素活性最高。本研究将该酶展示在酵母菌细胞表面上,并用于1-蔗果三糖的制备。【方法】将来自莴苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因克隆到用于酵母细胞表面展示的表达载体上,并在解脂亚罗酵母菌中进行异源表达,表达的酶展示在该细胞表面上,然后以蔗糖为底物,研究表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的性质。【结果】免疫荧光实验结果表明蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶已展示在酵母菌的细胞表面上,高效液相色谱结果表明酵母表面展示的该酶具有转移酶的催化活性。该酶的最适作用温度、最适作用p H分别为45°C和7.5;该酶的催化活性受Zn2+和Cu2+的抑制,受Ca2+激活;该酶重复使用7次后,酶活下降50%。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶和3%蔗糖混合后在40°C条件下孵育30 min后,所产1-蔗果三糖含量最高为20.8 mmol/L。【结论】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶在解脂亚罗酵母菌中得到成功表达,并展示在其细胞表面上,生化研究表明该重组蛋白具有果糖基转移酶活性,且催化蔗果三糖的生成。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶作为一种全细胞催化剂能够用于1-蔗果三糖的制备。

黄精炮制品多糖多元指纹图谱的建立及化学模式识别

目的构建黄精炮制品多糖的酶水解产物指纹图谱,结合化学计量学方法评价不同蒸晒次数黄精炮制品多糖的差异。方法采用糖苷酶水解,结合高效薄层色谱(high thin-layer chromatography,HPTLC)、亲水作用色谱-高效液相色谱-蒸发光检测器(hydrophilic interaction liquid chromatography-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector,HILIC-HPLC-ELSD)和超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(ultra high pressure liquid chromatographyquadrupole time of flight tandem mass spectrometry,UHPLC-QTOF/MS)对相应的酶解产物进行高效分离和检测。由此产生的自下而上的指纹图谱反映了黄精炮制品多糖的变化,通过相似度和偏最小二乘-判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)对指纹图谱进行综合评价。结果HPTLC分析发现,果糖随着蒸晒次数的增加逐渐降低,结合色谱分析发现,六蒸六晒和十二蒸十二晒为黄精炮制过程中的转折点。同时根据酶水解中寡糖的变化,利用相似度和PLS-DA对不同蒸晒次数的黄精炮制品进行了清晰的聚类。结合UHPLC-QTOF/MS分析表明,不同蒸晒次数黄精炮制品中含有蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖及蔗果八糖。结论基于酶解法分析不同蒸晒次数样品的质量动态变化,结合所建立的多元指纹图谱,进一步阐释了不同蒸晒次数黄精炮制品的科学内涵。