花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶（sucrose synthase,SuSy）是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因,命名为AhSuSy（Gen Bank登录号为JF346233）。该基因cDNA序列全长2790bp,包含一个2421bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区57bp,3端非编码区为312bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸,与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy,在IPTG诱导下得到92kD左右的蛋白,与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗,分析胁迫后AhSuSy的转录水平,同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量,发现三者均表现为处理后4~12h逐渐升高,相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993（P=0.007〈0.01）,处理后12~24h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控,在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。

蔗糖合酶基因启动子克隆及其转基因水稻植物中特异性表达

以水稻品种“明恢 6 3”基因组 DNA为模板 ,用 PCR方法克隆出水稻蔗糖合酶基因起始密码子以前 (包括第一内含子 )的上游序列 RSP1及其不包括第一内含子的上游调控序列 RSP2。测序结果显示 ,在重要的功能区段上 ,克隆的序列与 Wang(1992 )等的报道基本一致。构建了由 RSP1和 RSP2驱动报告基因 Gus的植物表达载体 ,并用于农杆菌介导法水稻遗传转化。对水稻品种“秀水 11”转基因植株各部位的 GUS组织化学分析表明 :RSP1和 RSP2都可以驱动Gus基因在根、茎、叶及颖壳中高效特异表达 ,但在胚和胚乳中不表达。作者认为 。

甜菜蔗糖磷酸合酶基因(BvSPS1)的克隆、表达及酶活性分析

蔗糖磷酸合酶是植物中控制蔗糖合成过程中催化6-磷酸果糖转化为蔗糖的关键酶。为了研究该基因的表达特性,本实验采用RT-PCR方法从甜菜中克隆甜菜蔗糖磷酸合酶基因(BvSPS1)。BvSPS1开放阅读框为3138bp,编码1045个氨基酸。推测BvSPS1氨基酸序列跨膜区域位于第561～593位,与酿酒葡萄(Vitis vinifera)和烟草(Nicotiana tabacum)的序列同源性分别为75.45%和74.59%。利用半定量RT-PCR对BvSPS1进行组织特异性表达检测,结果表明该基因主要在主根及侧根表达,在叶和叶柄中表达较弱,酶活性分析结果与之相同。离体叶片在10%葡萄糖溶液中培养6～12h后,BvSPS1基因表达水平提高,在10%蔗糖中培养相同时间则无变化。

山新杨蔗糖合酶基因PCR介导的重组现象研究

【目的】山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)是林木基因工程育种基础和应用研究的良好材料;以山新杨蔗糖合酶基因(PdbSUS)为例研究聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)过程介导的重组现象,在此基础上区分每一个PdbSUS基因的两种单倍型,为后续研究提供准确的序列信息,并为判断木本植物基因真实的单倍型遗传信息提供参考。【方法】分别采集番茄(Lycopersicon esculentum)和山新杨新鲜嫩叶,以番茄基因组为内参,利用流式细胞仪测定山新杨基因组大小及其倍性水平。参考毛果杨(P.trichocarpa)蔗糖合酶序列设计引物,分别以山新杨基因组DNA和cDNA为模板进行同源克隆,将PCR扩增产物回收纯化,连接测序载体并转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆进行菌液PCR验证,将整合有外源片段的转化子进行一代测序。利用SnapGene及DNAMAN软件对测序结果进行分析比对。【结果】山新杨为二倍体植物,获得了7个PdbSUS基因的全长序列,并分别在基因组和转录水平鉴定出每个基因的两种单倍型序列。同时,检测到PCR介导的重组现象并通过限制性酶切多态性(RFLP)进行了验证。在测序的209个克隆中,发现有18个含有嵌合产物,占比8.6%,不同基因产生嵌合产物的概率为0~33.3%。检测到的嵌合产物均来自同一个位点的不同等位基因之间发生重组,未发现不同蔗糖合酶基因之间发生重组的现象。【结论】PCR介导的重组是PCR反应过程中能够衍生重组分子的一种高频事件,该现象可能是由于引物延伸不完全或聚合酶模板转换导致。在利用PCR技术克隆木本植物或其他基因组杂合度较高物种的基因时,需识别产物中重组分子才能够准确区分单倍型的遗传信息。

哈姆林甜橙蔗糖合酶Ⅰ和酸性转化酶基因表达与果实糖积累的关系

蔗糖合酶(Sucrose synthase,SS)与酸性转化酶(Acid invertase,AI)是甜橙糖代谢过程中的两个关键酶,SS催化尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖和果糖合成蔗糖的可逆反应,AI则不可逆的催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖,它们在甜橙糖代谢过程中起着重要作用。笔者以哈姆林甜橙品种为试验材料,采用半定量RT-PCR法,对4个时期哈姆林叶片中的SSI基因和AI基因的表达进行了分析。结果表明,4个时期哈姆林叶片中均可检测到SSI基因和AI基因在转录水平上的表达,但表达量存在差异。SSI基因在果实发育过程中表达量呈"低-高-低-高"趋势。AI基因在哈姆林果实发育成熟过程中的表达逐渐减弱,与果实糖累积呈负相关。

植物SUS基因家族的系统进化及其在玉米中的干旱诱导表达分析

利用生物信息学方法从50个物种内鉴定出283个蔗糖合酶(SUS)家族成员,对鉴定出的SUS家族成员进行系统发育分析、共线性分析、蛋白理化性质和亚细胞定位分析,以及干旱胁迫下玉米SUS基因在不同组织的表达模式分析,综合全面地分析了SUS基因家族的进化规律。系统发育树分析表明:SUS家族可划分为SUSⅠ、SUSⅡ、SUSⅢ三个亚家族,SUSⅢ内部双子叶植物进化枝明显分为两个拓扑结构相似的进化枝;亚细胞定位结果显示SUS蛋白主要在细胞质和细胞核中发挥作用,且SUSⅢ成员的理化性质与SUSⅠ、Ⅱ之间差异明显;共线性结果表明:SUSⅠ、Ⅱ中的共线性基因分别聚成一个独立的亚群,SUSⅢ的共线性基因聚成两个亚群;RNA-seq数据表明:玉米SUS基因Zm00001d045042、Zm00001d029087、Zm00001d029091、Zm00001d014876在干旱胁迫下呈现差异表达,该表达模式分别与各亚家族的基因结构模式较为一致。综合上述研究,推测出植物SUS基因的进化轨迹,即在蕨类植物到种子植物进化过程中分化出SUSⅢ,在被子植物分化以前出现SUSⅠ和SUSⅡ,且SUSⅢ在双子叶植物中具有继续分化的趋势。

Xa21全生育期表达载体的构建

利用PCR技术,以水稻品种明恢63基因组DNA与携Xa21完整基因组片段的载体pDBXa21作为模板,分别克隆了RSuS1启动子(RSP)、Xa21的开放阅读框至终止子的片段,并构建了RSP驱动水稻广谱抗白叶枯病基因Xa21的转基因表达载体。实时荧光定量PCR技术证实,水稻蔗糖合酶基因1(rice sucrose synthase gene 1,RSuS1)在水稻种子中低表达,在叶鞘与叶中全生育期高效表达。