用蔗糖密度梯度离心法纯化小球隐孢子虫卵囊试验

用蔗糖密度梯度离心法从接种犊牛粪便中纯化小球隐孢子虫卵囊 ,该方法操作简便、快速、经济、获得的卵囊纯度高 ,回收率达 92 .0 % ,适合于国内普通实验室使用。

用蔗糖密度梯度离心法提纯禽脑脊髓炎病毒

用蔗糖密度梯度离心法进行了禽脑脊髓炎病毒的纯化。将禽脑脊髓炎病毒（ ＡＥＶ）Ｌ２Ｚ 株、Ｖａｎ Ｒｏｅｋｅｌ 株和１１４３ 株分别经卵黄囊接种６ 日龄ＳＰＦ 鸡胚，接毒后１３ 天，收集脑、消化道及胰腺，用玻璃匀浆器制成１０ ％ 的组织悬液。组织悬液经３ 次反复冻融后，以４５００ｒ／ｍｉｎ 离心１５ ｍｉｎ ，取上清液。而后用氯仿处理，取水相，经冷冻真空浓缩，进行不连续蔗糖密度梯度离心。取出含ＡＥＶ 的组分，用ＰＢＳ 稀释后超速离心除去蔗糖，得到提纯的病毒。病毒样品经２ ％ 磷钨酸负染，于电镜下观察可见典型的病毒粒子，大小为２４ ～２８ｎ ｍ 。

用于日立水平转头的等速蔗糖密度梯度液的制备

蔗糖密度梯度离心已经广泛应用。Martin,等给出在线性蔗糖密度梯度中计算粒子沉降系数的数值表。但计算沉降系数仍然费时,Noll提出等速蔗糖密度梯度。构成等速蔗糖密度梯度液的一些参数随水平转头的参数不同而异。在SPinco/Beckman的水平转头上构成等速蔗糖密度梯度所需的参数已有报道。

离心分析用蔗糖密度梯度简易制备法

在生化分析研究工作中,经常需要使用蔗糖密度梯度离心分析。制备蔗糖密度梯度的装置,在国外多已商品供应,如瑞典LKB公司出售的密度梯度分配器就是比较完善的工具。在国内尚无成品供应,由于在研究工作中需要使用蔗糖密度离心分析,就促使设计制作小型简易蔗糖密度梯度分配器,如附图1所示。 蔗糖密度梯度分配器分下列几个部分: ①蔗糖梯度母液玻璃容器:每组由两个直径相等的玻璃管组成,一组玻管内径为0.8cm,高8cm,可为5ml离心管制备蔗糖梯度溶液。另一组玻管内径为2.6cm,高9cm,可为30ml的离心管制备蔗糖梯度溶液,或可供70ml以下线性梯度溶液洗脱小型层析柱用。每组管子其中一只下部烧结上两个对称的小玻管开口,另一只仅烧结一个小玻管开口,两玻管之间用聚乙烯管相连,用螺旋夹夹住。

蔗糖密度梯度法定量口蹄疫完整病毒粒子(146S)的特异性研究

为验证蔗糖密度梯度法检测口蹄疫完整病毒粒子(146S)的特异性,选择pH值6.0、5.0、4.0 PBS酸解处理3批提纯后的146S灭活抗原液,并将酸解后样品进行146S检测,发现8至11级份OD259峰值消失,146S含量由酸解前的1.77、6.60、3.67μg/mL至酸解后完全不能检测到。同时对3批不含病毒的细胞液按抗原纯化灭活工艺处理后进行146S检测,结果显示3批细胞液在8至11级份均没有明显吸收峰,而且其OD259值与PBS空白对照OD259值基本平行一致,说明不含病毒的细胞液对检测结果没有明显干扰。试验证明,蔗糖密度梯度法定量FMD病毒液中146S含量具有很好的特异性。

蔗糖密度梯度离心提取满江红体内鱼腥藻方法的研究

为了从满江红体内分离到纯净度高的红萍鱼腥藻，在Hitachi55P－72超速离心机上试验了1．0～2．0M，1．0～2．5M和1．2～2．5M三种蔗糖连续密度梯度，7500rpm，15000rpm和20000rpm三种离心速度，30min和60min两种时间条件下红萍体内鱼腥藻粗提物的分带情况。结果表明用1．2～2．5M蔗糖密度梯度。15000rpm和60min的离心条件可取得最好的分带效果。用红萍体内单克隆抗体检验分离后的红萍体内查腥藻，证实它们与原红萍材料中的鱼腥藻同源。

蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒工艺的优化

目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量（600、700和800 ml）时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝素含量检测,确定最佳收峰位置、糖度范围及病毒浓缩液进样量;在不同比例的30%和50%的蔗糖溶液、不同离心时间（2、3和4 h）条件下对流感病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心纯化,检测纯化后的病毒纯化液蛋白质、血凝素及卵清蛋白含量,计算蛋白质含量与血凝素含量比值及血凝素回收率,确定最佳离心时间。结果确定最佳收峰位置为第三峰,糖度范围为30%~50%之间;当病毒浓缩液进样量为600~700 ml时,30%蔗糖溶液进液量为450~550 ml,55%蔗糖溶液进液量为400~500 ml,转速为90 639×g离心3 h后,可获得最佳纯化效果。结论确定了蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的最佳工艺参数,为进一步提高流感病毒的纯化效果提供了参考。

蔗糖密度梯度离心技术纯化山羊痘病毒的研究

为了提纯细胞培养物中的山羊痘病毒（Goat pox virus,GTPV）,试验采用低速离心法去除大部分细胞碎片,之后加入聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀病毒,用蔗糖密度梯度离心技术进行纯化,然后用双抗体夹心ELISA和电镜观察法对纯化的病毒进行检测。结果表明：病毒得到有效富集,电镜观察可见完整病毒颗粒且背景清晰。说明蔗糖密度梯度离心技术可以有效纯化细胞培养物中的GTPV,且能保留其免疫原性。

二次蔗糖密度梯度离心纯化线粒体

该研究以小鼠肝组织和脑组织为原材料,对常规的差速离心法结合密度梯度离心纯化线粒体的方法进行改进,发现在常规操作步骤上增加一次非线性蔗糖密度梯度离心可以有效地提高线粒体纯度。透射电镜及免疫印迹鉴定结果显示,增加一次密度梯度离心后,线粒体纯度大大提高,而对线粒体得率影响有限。虽然这样延长了实验时间,但线粒体膜电位及琥珀酸脱氢酶比活实验证实,在线粒体纯度获得提高的同时,其活力并没有受到明显影响。因此,建议在进行线粒体蛋白质组检测等对线粒体纯度有较高要求的实验时,可以增加一次或者二次非线性蔗糖密度梯度离心,在维持线粒体活力的同时,提高其纯度,有利于后续实验的开展。

一种连续蔗糖密度梯度离心分离哺乳动物细胞核糖体前体和核糖体的技术优化

目的利用连续蔗糖密度梯度的方法分离提取哺乳动物细胞的核糖体前体和核糖体。方法采用超速离心法建立连续蔗糖密度梯度，分别用梯度为10％～30％和10％-45％的连续蔗糖密度梯度提取哺乳动物细胞内的核糖体前体和核糖体；然后将哺乳动物细胞裂解液加入到已建立好的连续蔗糖密度梯度上进行超速离心；再将不同沉降系数的核糖体前体和核糖体收集到不同的1．5ml离心管中，测量每一个样品的吸光度值A。并提取其中的蛋白质，利用WesternBlot检测核糖体大亚基蛋白RPL15的定位。结果核糖体大亚基蛋白RPL15位于核糖体前体的60S上和成熟核糖体的60S、80S和多聚核糖体上。结论利用水平转头建立的连续蔗糖密度梯度可快捷分离哺乳动物细胞内的核糖体前体和核糖体。该法分离效果好，操作简单，为快速和大量制备、分离多种核糖体提供了一种良好的方法。

狂犬病疫苗蔗糖密度梯度离心纯化工艺开发

目的:开发冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的连续流蔗糖密度梯度离心纯化工艺。方法:分别比较两种不同初始蔗糖浓度和不同上样速度对纯化效果的影响,初步确定纯化工艺;通过多批次实验确定样品收集范围;比较不同浓缩倍数条件下杂质去除和抗原回收情况,确定合适的收获液浓缩比例;比较不同批次样品纯化后的杂质去除率和重复性,判定本纯化工艺的稳定性。结果:选取60%作为初始蔗糖浓度,在上样速度为150~200ml/min时,可以有效地对10倍浓缩的病毒收获液进行纯化;卵清蛋白、牛血清白蛋白和庆大霉素去除率分别达到99%,95%和95%,且工艺具有极好的稳定性。结论:开发的连续流蔗糖密度梯度离心技术可以作为冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的产业化纯化工艺。

应用硫酸鱼精蛋白处理蔗糖密度梯度超速离心高度纯化流行性乙型脑炎灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)

目的通过离心试验,制备出一种高纯度的流行性乙型脑炎(乙脑)灭活纯化疫苗(非洲绿猴肾细胞)[Purified Inactivated Japanese Encephalitis Vaccine(Vero Cell),JEV]。方法生物反应器培养的Vero细胞乙脑病毒液,超滤浓缩、甲醛灭活后,应用硫酸鱼精蛋白处理,再经过高速离心,蔗糖密度梯度超速离心纯化,超滤除糖,配制成JEV(Vero细胞)。结果经检测,疫苗中Vero细胞脱氧核糖核酸残留量≤10pg(皮克,Picogram)/剂,蛋白含量≤1μg(微克)/剂,宿主蛋白残留量≤30ng(纳克,Nanogram)/ml,并获得较高的抗原回收率。结论经过优化硫酸鱼精蛋白处理和蔗糖密度梯度超速离心纯化,制得了高纯度的JEV(Vero细胞)。

根肿(Plasmodiophora brassicae)休眠孢子的纯化和超声波破碎方法研究

根肿(Plasmodiophora brassicae Woronin)是严重危害十字花科植物的世界性病害.采用蔗糖密度梯度离心和超声波处理方法从油菜染病根部组织分离和提纯根肿休眠孢子.众多因素可以影响提纯休眠孢子的纯度,为了得到更高纯度和均匀度的休眠孢子的优化方法,我们对一系列影响因素如超声波破碎功率、pH、孢子破碎浓度、处理时间和不同的水溶物质等进行了研究.在pH值5.5左右、添加0.5%的二甲基亚砜、孢子浓度约为7×108、345W功率下超声波处理10min条件下获得了最优数量和均匀度的孢子,杂菌数量减少了51%以上,杂菌种类减少超过75%.超声波处理50min后,孢子破碎率稳定地达到90%以上,除菌率达99%以上.用此方法能在较短时间内获得高纯度和高均匀度的休眠孢子,为休眠孢子的深入研究提供了资料.

应用区带离心法纯化地鼠肾细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的应用区带离心法纯化原代地鼠肾细胞乙型脑炎灭活疫苗。方法浓缩的原代地鼠肾细胞乙脑灭活疫苗,经36％和60％不连续蔗糖密度、23 000r/min离心4h后,收取纯化的乙脑抗原组分,制成纯化乙脑疫苗。结果浓缩疫苗经一步区带离心纯化后,抗原效价提高3倍以上,蛋白去除99.5%以上。经稀释制成的半成品疫苗与未经浓缩的原疫苗相比,抗原效价提高4倍以上,蛋白去除99％以上。结论区带离心法可用于纯化地鼠肾细胞乙脑疫苗。

大鼠不饱和脂肪酸的代谢变化与衰老的关系

目的 探讨衰老与细胞内不饱和脂肪酸代谢变化的关系。方法 采用蔗糖密度梯度离心法分离大鼠肝脏线粒体和微粒体 ,用毛细管气相色谱法测定了青年和老年大鼠肝组织、肝线粒体和微粒体中的 1 4种脂肪酸 ,获取有统计意义的数据。结果 6种不饱和脂肪酸的总量占所测 1 4种脂肪酸总量的比例 ,老年组均小于青年组 (P<0 .0 5)。结论 随着增龄 ,自由基介导的脂质过氧化程度不断加强 。

抗牛安氏隐孢子虫单克隆抗体的研制与初步鉴定

通过流行病学调查分离到奶牛隐孢子虫虫株,经实验室鉴定为牛安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni),经蔗糖漂浮法收集和蔗糖密度梯度离心、滤器滤过、多次低速离心提纯后,通过冻融和超声波处理的全卵囊抗原免疫Balb/c小鼠4次,取阳性小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合.经间接ELISA方法筛选,有限稀释法3～4次克隆,获得5株分泌抗牛安氏隐孢子虫(C.andersoni)单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1A3,3B10,3F4,4B3,4F11).5株单抗的染色体数目平均在96～98条之间,上清效价分别在1:100和1:12 800之间,腹水效价分别在1:12 800和1:204 800之间.采用免疫荧光法对各株的单抗腹水进行初步鉴定,发现其中4株为抗卵囊壁单抗,1株为抗子孢子单抗.对其中3株单抗的腹水提纯后进行SDS-PAGE电泳分析,其重链分子量约为52.7kDa,轻链分子量约为24kDa.

以小麦根尖分生组织细胞核及染色体制备高分子量DNA

为了克服以叶片为材提取HMW DNA的局限性,优化了一套简便、实用的提取方法。该法以细胞周期同步化处理的根尖分生组织为材料,利用机械匀浆释放细胞核或中期染色体制备悬浮液,再以蔗糖密度梯度离心和流式分选技术分别分离细胞核和染色体,经去蛋白、酶切、透析,获得HMW DNA。经检测,来自200条根尖(10个胶块)的HMW DNA的浓度约为4～20ng/μL,而连接、转化后的BAC克隆平均插入片段超过100kb。证明该法适用于提取HMW DNA以构建BAC文库。

甲型流感病毒纯化及病毒生物学特征分析

目的评价蔗糖密度梯度离心纯化甲型流感病毒的方法,并对纯化的病毒颗粒特征和免疫原性进行分析。方法接种鸡胚培养病毒,收获尿囊液,超速离心浓缩,蔗糖密度梯度离心纯化病毒,用血凝试验、蛋白定量、透射电镜和SDS-PAGE鉴定病毒颗粒。取病毒纯化产物以0.03mg/只和0.005mg/只分组免疫小鼠,采集小鼠血清,利用血凝抑制试验测定血清血凝抑制滴度。结果成功利用蔗糖密度梯度离心法纯化出流感病毒,病毒原液经纯化后被分离成L、M、H三个病毒带,其中M病毒带的吸光度、蛋白浓度及血凝滴度最高,蛋白浓度可达1.2mg/mL,血凝滴度高达1×49。电镜观察显示,L区带为具有血凝活性的质膜和结构疏松的病毒组成,M区带病毒颗粒呈球形、丝状或棒状。同时,有大量空心病毒颗粒存在。H区带与M区带类似,但未发现空心病毒颗粒。纯化的病毒免疫小鼠后可产生具有较高血凝抑制活性的抗体。结论蔗糖密度梯度离心技术可用于流感病毒抗原的制备,且不影响病毒的免疫原性。因此,密度梯度离心法可为流感病毒的基础研究及疫苗开发提供技术支持。

从感染小鼠获得微小隐孢子虫卵囊方法的改进

目的 建立从感染C5 7BL/ 6N小鼠获得大量微小隐孢子虫卵囊的方法。方法 在饮水中添加不同浓度的地塞米松对人工感染小鼠进行免疫抑制 ,探讨获得最多卵囊数的药物添加量 ;比较不同纯化方法得到的卵囊回收率和纯度 ;探讨来自不同动物、不同纯化方法的卵囊在牛输卵管上皮细胞培养系统的感染情况。结果 地塞米松加入量为 2 0 μg/ml的第 3组获得的卵囊量高达 4 .16× 10 9/ 30个小鼠 ;用饱和盐水漂浮法与用蔗糖密度梯度离心法纯化得到的卵囊具有相同的回收率和纯度 ;从感染小鼠与犊牛中获得的卵囊在感染性上差异不显著。结论 成功地建立了从感染小鼠获得大量微小隐孢子虫卵囊的方法 ,具有简单、方便、快速等优点 ,并且不影响活力。

从鼠粪中分离纯化微小隐孢子虫卵囊方法的研究

目的探索一种实用、纯度和回收率高且卵囊活力强的分离纯化微小隐孢子虫卵囊的方法。方法分别采用经典的不连续蔗糖密度梯度离心法、改良饱和盐水漂浮法、氯化铯(CsCl)密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法分离纯化C57BL/6小鼠粪中隐孢子虫卵囊。并将4种方法分离纯化获得的卵囊各105体外感染牛输卵管上皮细胞(BFTE),48h和72h后油镜下观察各分离法卵囊的发育情况,以比较卵囊的纯度和活性。结果经典的不连续蔗糖密度梯度离心法分离获得的卵囊数[(2.86±0.08)×107]与改良饱和盐水漂浮法[(2.88±0.15)×107]无明显差异(P>0.05),但高于Percoll密度梯度离心法[(1.52±0.08)×107](P<0.01)和CsCl密度梯度离心法[(2.46±0.13)×107](P<0.05)。4种方法分离纯化的卵囊体外感染BFTE48h和72h后隐孢子虫数无明显差异(P>0.05)。但CsCl密度梯度离心法纯化的隐孢子虫卵囊纯度明显高于不连续蔗糖密度梯度离心法。结论改良饱和盐水漂浮法较经典的不连续蔗糖密度梯度离心法操作简单、快速;CsCl密度梯度离心法分离的隐孢子虫卵囊纯度较高。