转蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性

蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶(sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase,1-SST)以蔗糖为底物催化生成蔗果三糖等低聚合度的果聚糖.将从莴苣中克隆的1-SST基因重组到pCAMBIA1300-als中,构建了在CaMV 35S启动子调控下的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘转化法将1-SST基因导入烟草中,PCR和Southern杂交检测表明获得了转基因植株,RT-PCR结果表明该基因在烟草中正常表达.对T0代转基因烟草进行的耐旱性分析结果表明,干旱胁迫6 d的转基因植株丙二醛含量和电解质渗漏率显著低于未转基因对照,叶片相对含水量下降速度也明显比对照慢.对转基因植株叶片糖分分析表明,转基因烟草植株积累果聚糖,并在干旱胁迫后含量明显增加,而未转基因对照植株不积累果聚糖.在14%PEG溶液中未转基因烟草种子的萌发率仅为转基因烟草种子的一半;在附加200 mmol/L甘露醇的培养基中未转基因烟草种子根的生长明显受到抑制,而转基因烟草根的生长发育正常.以上研究结果表明,转1-SST基因烟草植株耐旱性的提高可能与该基因的表达有关.

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征

【目的】研究大蒜(Allium sativum L.)中蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征,为大蒜保鲜、加工和品质改良提供依据。【方法】采用饱和度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的硫酸铵分级沉淀1-SST,以确定其所在的硫酸铵部位。分别取1-SST活力最高的硫酸铵部分与底物蔗糖反应,研究其在不同的温度、p H、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖的能力,即采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD),测定1-SST反应前后的1-蔗果三糖的含量,进而计算出1-SST活力大小并总结出其在不同的温度、p H、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖反应的规律;采用的色谱柱为Prevail Carbohydrate ES柱(250 mm×4.6 mm,5μm),色谱柱柱温箱温度为40℃,流动相最大限压20 MP,流动相为乙腈和水,其流速为1.0 m L·min-1,ELSD撞击器关闭状态,漂移管温度90℃,载气流量2.5 L·min-1(空气)。其梯度洗脱方式为:0 min,75%乙腈﹕25%水;15 min,65%乙腈﹕35%水;30 min,50%乙腈﹕50%水;35 min,75%乙腈﹕25%水;40 min,75%乙腈﹕25%水。【结果】在上述测定条件下,果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖6种糖完全分离,出峰时间仅为20 min,测定方法可靠、灵敏度高,满足了测定1-SST活性的要求。以50%(w/w)蔗糖为底物时,仅产生1-蔗果三糖,无其它高果聚糖的产生,证实了在所试条件下,大蒜中1-SST反应具有专一性。大蒜1-SST主要存在于30%—40%硫酸铵饱和度部分,其中0—30%,40%—70%有轻微活力,未发现70%—100%硫酸铵组分有1-SST的活力。取30%—40%的硫酸铵饱和度部分作为样品研究1-SST酶学特征发现其最适反应温度为35℃,当温度到达40℃以上时,酶的活力下降的很快,说明1-SST具有热不稳定性,因此在研究大蒜1-SST时,要尽量避免高温,以免影响后续研究;其最适反应p H为5.0,与大麦(Hordeum vulgare)、菊苣(Cichorium intybus L.)、菊芋(Helianthus tuberosus Colombia)、黑麦草(Lolium rigidum)、龙舌兰(Agave americana L.)的1-SST最适p H大致相同,显示不同植物1-SST活力中心部位的结构可能基本一致;在蔗糖浓度为100—600 mg·m L-1内,酶活力随着底物质量浓度的增加而提高,而当底物浓度超过500 mg·m L-1时,酶活力增加的幅度减少而趋于平缓,这完全符合米氏方程(Michaelis-menten)的酶动力学性质;对于Na+、Cl-来说,离子强度越低,1-SST活力越强,1-SST在35℃下的米氏常数Km为104mmol·L-1。【结论】大蒜1-SST随温度、p H、离子强度、底物质量浓度等变化,不仅影响大蒜贮藏过程中的果聚糖代谢,也影响大蒜加工产品,尤其是大蒜提取物中糖的种类和含量。

蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的表面展示及酶学性质分析(英文)

【目的】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶催化1分子蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上,形成1-蔗果三糖和葡萄糖。在低聚果糖中,1-蔗果三糖益生素活性最高。本研究将该酶展示在酵母菌细胞表面上,并用于1-蔗果三糖的制备。【方法】将来自莴苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因克隆到用于酵母细胞表面展示的表达载体上,并在解脂亚罗酵母菌中进行异源表达,表达的酶展示在该细胞表面上,然后以蔗糖为底物,研究表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的性质。【结果】免疫荧光实验结果表明蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶已展示在酵母菌的细胞表面上,高效液相色谱结果表明酵母表面展示的该酶具有转移酶的催化活性。该酶的最适作用温度、最适作用p H分别为45°C和7.5;该酶的催化活性受Zn2+和Cu2+的抑制,受Ca2+激活;该酶重复使用7次后,酶活下降50%。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶和3%蔗糖混合后在40°C条件下孵育30 min后,所产1-蔗果三糖含量最高为20.8 mmol/L。【结论】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶在解脂亚罗酵母菌中得到成功表达,并展示在其细胞表面上,生化研究表明该重组蛋白具有果糖基转移酶活性,且催化蔗果三糖的生成。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶作为一种全细胞催化剂能够用于1-蔗果三糖的制备。

弱光对冬小麦茎中果聚糖代谢的影响

以耐弱光性不同的冬小麦品种‘扬麦158’(耐弱光品种)和‘扬麦11’(不耐弱光品种)为材料,研究了拔节至成熟期遮光对小麦籽粒淀粉积累量、茎中花前贮存果聚糖转运以及果聚糖代谢关键酶活性的影响。结果表明:拔节至成熟期遮光降低了小麦茎中花前贮存果聚糖的转运量,提高了贮存果聚糖对小麦淀粉产量的贡献率。遮光降低了小麦灌浆前中期茎中蔗糖∶蔗糖果糖基转移酶(SST)和果聚糖∶果聚糖果糖基转移酶(FFT)活性,不利于果聚糖积累,从而导致茎中可溶性碳水化合物积累量下降。遮光条件下灌浆中后期小麦茎中果聚糖外水解酶(FEH)活性下降,分解果聚糖向外转运的能力降低,故向籽粒中转运的量下降,最终导致小麦籽粒淀粉积累量显著降低。遮光33%时小麦籽粒淀粉积累量的下降幅度大于遮光22%,且‘扬麦11’的下降幅度大于‘扬麦158’。

MLL启动子驱动SST基因转化甜菜的抗旱性分析

将洋葱(Allium cepa)的蔗糖-果糖基转移酶基因SST与甜菜根部特异性启动子MLL重组,以p BI121为起始载体,构建p BI121-MLL-SST,通过农杆菌介导法转化甜菜(Beta vulgaris)品种STFD4,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,简称PCR)鉴定转化植株,并用逆转录PCR(reverse transcription PCR,简称RT-PCR)技术检测SST基因的表达。利用干旱胁迫处理进行抗旱性分析,结果表明,与对照(CK)相比,转SST植株叶片萎蔫较迟且程度较轻,其叶片相对含水量和光系统Ⅱ相对量子产率的降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的提高幅度均低于对照甜菜植株。以上结果表明,SST基因可明显提高甜菜的抗旱性,为进一步研究该基因在甜菜中的功能奠定了基础。