蔗糖梯度离心纯化人类中期染色体

蔗糖梯度离心纯化人类中期染色体①施家琦唐冬生夏家辉（湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室，长沙４１００７８）ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＭｅｔａｐｈａｓｅＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｂｙＳｕｃｒｏｓｅＧｒａｄｉｅｎｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎＳ...

蔗糖密度梯度离心技术纯化山羊痘病毒的研究

为了提纯细胞培养物中的山羊痘病毒（Goat pox virus,GTPV）,试验采用低速离心法去除大部分细胞碎片,之后加入聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀病毒,用蔗糖密度梯度离心技术进行纯化,然后用双抗体夹心ELISA和电镜观察法对纯化的病毒进行检测。结果表明：病毒得到有效富集,电镜观察可见完整病毒颗粒且背景清晰。说明蔗糖密度梯度离心技术可以有效纯化细胞培养物中的GTPV,且能保留其免疫原性。

用蔗糖密度梯度离心法纯化小球隐孢子虫卵囊试验

用蔗糖密度梯度离心法从接种犊牛粪便中纯化小球隐孢子虫卵囊 ,该方法操作简便、快速、经济、获得的卵囊纯度高 ,回收率达 92 .0 % ,适合于国内普通实验室使用。

结合态PC645组分的分离纯化和性质

采用蔗糖密度梯度离心方法从蓝隐藻(Chroomonas placoidea)中分离得到了含有结合态藻蓝蛋白PC645的Chl-蛋白条带BandⅢ;硫酸铵分级沉淀显示,50%硫酸铵可最有效去除其中大部分Chl-蛋白且有效避免PC645的损失。光谱和多肽分析表明,含量最丰富的BandⅠ的亚基主要为1型,说明PC645占主导的α1α2β1β2异二聚体形式主要以游离态存在于类囊体腔中;而BandⅢ中富含的2型亚基参与形成的异二聚体很可能为α1α2β1β2,其疏水性更强,更易于被盐析沉淀。硫酸铵分级沉淀后的BandⅢ经疏水层析得到的疏水程度较低的组分1同时含有PC645和Chl a-蛋白;疏水程度最高的组分4,为基本不含叶绿素的、充分纯化的PC645,且很可能是BandⅢ中与Chl-蛋白处于结合态的PC645组分。结果为今后隐藻两套捕光系统结构和相互作用机制研究奠定了基础。

TGEV细胞培养物超速离心与RT-PCR扩增的研究

研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)细胞培养物的超速离心及鉴定方法。将TGEV的细胞培养物用饱和硫酸氨法浓缩后,用200 g/kg^500 g/kg蔗糖密度梯度离心分装,测定蛋白浓度并取峰值管进行RT-PCR,并设立15、25、35三个不同循环参数测定PCR产物volume值。结果表明,在35个循环条件下第14号样品PCR产物的volume值最大,表明该样品病毒核酸的含量最大,由此推算病毒粒子主要集中在360 g/kg^380 g/kg蔗糖区带处,这与理论值相符,证明猪传染性胃肠炎病毒经密度区带离心后,利用PCR产物量确定目的病毒区带效果显著。

不同离心力分离外周血单个核细胞的条件优化

目的观察不同离心力对人外周血单个核细胞(PBMC)分离的影响。方法采用聚蔗糖密度梯度离心法分离人外周血中PBMC,不同分离离心力及洗涤离心力获取细胞,利用流式细胞仪检测细胞得率和存活状况,并进行统计学分析。结果分离离心力结果:离心力600g时获取的细胞数最多;24h检测的凋亡细胞数在离心力300～900g分离时差异无统计学意义(P>0.05)且相对较少,增加离心力,凋亡细胞数增加;72h检测离心力大于1 200g或低至300g时,存活细胞数显著减少。洗涤离心力结果:离心力150g时细胞得率显著低于300～2 400g时;24h检测细胞凋亡显示离心力大于600g时,凋亡细胞数增加;72h检测显示洗涤离心力大于1 200g时,存活细胞数显著减少。结论分离离心力在600～900g及洗涤离心力在300～600g均可用于PBMC的分离。

蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒工艺的优化

目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量（600、700和800 ml）时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝素含量检测,确定最佳收峰位置、糖度范围及病毒浓缩液进样量;在不同比例的30%和50%的蔗糖溶液、不同离心时间（2、3和4 h）条件下对流感病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心纯化,检测纯化后的病毒纯化液蛋白质、血凝素及卵清蛋白含量,计算蛋白质含量与血凝素含量比值及血凝素回收率,确定最佳离心时间。结果确定最佳收峰位置为第三峰,糖度范围为30%~50%之间;当病毒浓缩液进样量为600~700 ml时,30%蔗糖溶液进液量为450~550 ml,55%蔗糖溶液进液量为400~500 ml,转速为90 639×g离心3 h后,可获得最佳纯化效果。结论确定了蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的最佳工艺参数,为进一步提高流感病毒的纯化效果提供了参考。

二次蔗糖密度梯度离心纯化线粒体

该研究以小鼠肝组织和脑组织为原材料,对常规的差速离心法结合密度梯度离心纯化线粒体的方法进行改进,发现在常规操作步骤上增加一次非线性蔗糖密度梯度离心可以有效地提高线粒体纯度。透射电镜及免疫印迹鉴定结果显示,增加一次密度梯度离心后,线粒体纯度大大提高,而对线粒体得率影响有限。虽然这样延长了实验时间,但线粒体膜电位及琥珀酸脱氢酶比活实验证实,在线粒体纯度获得提高的同时,其活力并没有受到明显影响。因此,建议在进行线粒体蛋白质组检测等对线粒体纯度有较高要求的实验时,可以增加一次或者二次非线性蔗糖密度梯度离心,在维持线粒体活力的同时,提高其纯度,有利于后续实验的开展。

狂犬病疫苗蔗糖密度梯度离心纯化工艺开发

目的:开发冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的连续流蔗糖密度梯度离心纯化工艺。方法:分别比较两种不同初始蔗糖浓度和不同上样速度对纯化效果的影响,初步确定纯化工艺;通过多批次实验确定样品收集范围;比较不同浓缩倍数条件下杂质去除和抗原回收情况,确定合适的收获液浓缩比例;比较不同批次样品纯化后的杂质去除率和重复性,判定本纯化工艺的稳定性。结果:选取60%作为初始蔗糖浓度,在上样速度为150~200ml/min时,可以有效地对10倍浓缩的病毒收获液进行纯化;卵清蛋白、牛血清白蛋白和庆大霉素去除率分别达到99%,95%和95%,且工艺具有极好的稳定性。结论:开发的连续流蔗糖密度梯度离心技术可以作为冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的产业化纯化工艺。

HBV颗粒的纯化及生物学活性鉴定

目的优化纯化HBV患者血清中HBV颗粒的技术方法。方法在蔗糖介质中,分别以100 000 g和70 000 g进行不连续蔗糖梯度(60%,45%,35%,25%,15%)离心5 h,离心后,分段吸取6份收集液,PCR荧光定量检测各组分HBV滴度;收集前5份收集液进行超滤,去蔗糖,PCR荧光定量检测HBV超滤液;电镜观察70 000g纯化后的HBV超微形态;70000 g纯化后的HBV颗粒感染树鼩肝细胞,检验70 000 g纯化后的HBV感染活性。结果100 000 g离心造成大量HBV在离心过程中损失,收获率只有21%,70 000g离心不仅降低了离心中的病毒损失,而且可有效对HBV和血清进行分离,收获率达到78%以上,较100 000g还提高3.7倍多。电镜可观察到纯化后病毒液中有大量的病毒颗粒;纯化后的HBV颗粒感染活性良好,可有效感染原代树鼩肝细胞。结论70 000 g不连续蔗糖梯度离心可有效分离纯化HBV病毒,较100 000 g收获率明显提高,纯化后的HBV不但具有典型的HBV特征,还具有良好的生物学感染活性。

检测对虾白斑综合症病毒（WSSV）与宿主细胞结合的荧光素标记法

采用蔗糖梯度离心方法提取对虾的白斑综合症病毒(WSSV)，用荧光素对病毒进行标记。标记的病毒同原代培养的日本对虾组织细胞进行结合试验。在4℃结合1h，洗板去除未结合的病毒成分后，在荧光显微镜下可观察到培养的血细胞和鳃细胞带有绿色荧光，而肌肉细胞和卵巢细胞没有荧光产生，荧光的产生说明病毒与细胞已经结合。该方法与过去所用的方法相比，具有操作简便、快速、直观、消耗试剂少、比较经济等优点，可成为研究白斑综合症病毒和细胞结合的一种新方法。

抗猴逆转病毒Ⅰ型(SRV-1)杂交瘤细胞株的建立及应用

以SRV-1蔗糖梯度离心纯化抗原免疫SPF级的BALB/c小鼠,用SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞融合。应用间接免疫荧光法（IFA）检测抗体,抗原为感染SRV-110d的Raji细胞。筛选出两株SRV-1小鼠杂交瘤细胞株及单克隆抗体（McAb）C4和C15。两株杂交瘤细胞经3次克隆后分别注入同品系的小鼠腹腔,所产生的腹水经IFA和ELISA法测定其滴度为1:800～1:1600。经琼脂免疫双扩散法鉴定,C4

应用硫酸鱼精蛋白处理蔗糖密度梯度超速离心高度纯化流行性乙型脑炎灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)

目的通过离心试验,制备出一种高纯度的流行性乙型脑炎(乙脑)灭活纯化疫苗(非洲绿猴肾细胞)[Purified Inactivated Japanese Encephalitis Vaccine(Vero Cell),JEV]。方法生物反应器培养的Vero细胞乙脑病毒液,超滤浓缩、甲醛灭活后,应用硫酸鱼精蛋白处理,再经过高速离心,蔗糖密度梯度超速离心纯化,超滤除糖,配制成JEV(Vero细胞)。结果经检测,疫苗中Vero细胞脱氧核糖核酸残留量≤10pg(皮克,Picogram)/剂,蛋白含量≤1μg(微克)/剂,宿主蛋白残留量≤30ng(纳克,Nanogram)/ml,并获得较高的抗原回收率。结论经过优化硫酸鱼精蛋白处理和蔗糖密度梯度超速离心纯化,制得了高纯度的JEV(Vero细胞)。

伪狂犬病毒(PRV)间接ELISA试验

将PRVHB98株接种IB细胞,通过超声波破碎后利用蔗糖梯度离心纯化病毒作为ELISA抗原,配以HRP标记的酶标记物、TMB显色液、终止液组成PRV间接ELISA。对PRV间接ELISA各操作步骤进行试验,通过试验数据,确定ELISA的最佳操作方法。

根肿(Plasmodiophora brassicae)休眠孢子的纯化和超声波破碎方法研究

根肿(Plasmodiophora brassicae Woronin)是严重危害十字花科植物的世界性病害.采用蔗糖密度梯度离心和超声波处理方法从油菜染病根部组织分离和提纯根肿休眠孢子.众多因素可以影响提纯休眠孢子的纯度,为了得到更高纯度和均匀度的休眠孢子的优化方法,我们对一系列影响因素如超声波破碎功率、pH、孢子破碎浓度、处理时间和不同的水溶物质等进行了研究.在pH值5.5左右、添加0.5%的二甲基亚砜、孢子浓度约为7×108、345W功率下超声波处理10min条件下获得了最优数量和均匀度的孢子,杂菌数量减少了51%以上,杂菌种类减少超过75%.超声波处理50min后,孢子破碎率稳定地达到90%以上,除菌率达99%以上.用此方法能在较短时间内获得高纯度和高均匀度的休眠孢子,为休眠孢子的深入研究提供了资料.

以小麦根尖分生组织细胞核及染色体制备高分子量DNA

为了克服以叶片为材提取HMW DNA的局限性,优化了一套简便、实用的提取方法。该法以细胞周期同步化处理的根尖分生组织为材料,利用机械匀浆释放细胞核或中期染色体制备悬浮液,再以蔗糖密度梯度离心和流式分选技术分别分离细胞核和染色体,经去蛋白、酶切、透析,获得HMW DNA。经检测,来自200条根尖(10个胶块)的HMW DNA的浓度约为4～20ng/μL,而连接、转化后的BAC克隆平均插入片段超过100kb。证明该法适用于提取HMW DNA以构建BAC文库。

两种柑橘线粒体DNA的获得与AFLP分析

为了研究柑橘种属间线粒体基因组的遗传多样性以及温州蜜柑胞质雄性不育的分子基础 ,采用了两个柑橘品种‘国庆 1号’温州蜜柑和无核‘冰糖橙’的胚性愈伤组织作为提取线粒体的材料。不连续蔗糖梯度超速离心法纯化线粒体。提取的线粒体完整 ,具很强的荧光活性。mtDNA片段在 2 0kb左右 ,且无降解。叶绿体探针rubiscoL、核探针 4 5srRNASouthernblotting没有检测到叶绿体DNA与核DNA ,而线粒体探针apt6杂交获得一条 5kb大小的带 ,说明用此提取方法可获得无污染的mtDNA。 4对AFLP引物共得到 98条带 ,其中

两种方法纯化流感病毒的比较

目的比较两种方法纯化流感病毒的效果。方法取病毒原液,经超滤浓缩后,分别用Sepharose 4FF凝胶层析和蔗糖密度梯度离心法进行纯化,并对纯化产物进行检定。结果层析法的纯度、卵清蛋白及杂蛋白去除率略高于蔗糖密度梯度离心法,而蔗糖密度梯度离心法的病毒回收率优于层析法。结论两种方法均可用于流感病毒的纯化。

大鼠不饱和脂肪酸的代谢变化与衰老的关系

目的 探讨衰老与细胞内不饱和脂肪酸代谢变化的关系。方法 采用蔗糖密度梯度离心法分离大鼠肝脏线粒体和微粒体 ,用毛细管气相色谱法测定了青年和老年大鼠肝组织、肝线粒体和微粒体中的 1 4种脂肪酸 ,获取有统计意义的数据。结果 6种不饱和脂肪酸的总量占所测 1 4种脂肪酸总量的比例 ,老年组均小于青年组 (P<0 .0 5)。结论 随着增龄 ,自由基介导的脂质过氧化程度不断加强 。

甲型流感病毒纯化及病毒生物学特征分析

目的评价蔗糖密度梯度离心纯化甲型流感病毒的方法,并对纯化的病毒颗粒特征和免疫原性进行分析。方法接种鸡胚培养病毒,收获尿囊液,超速离心浓缩,蔗糖密度梯度离心纯化病毒,用血凝试验、蛋白定量、透射电镜和SDS-PAGE鉴定病毒颗粒。取病毒纯化产物以0.03mg/只和0.005mg/只分组免疫小鼠,采集小鼠血清,利用血凝抑制试验测定血清血凝抑制滴度。结果成功利用蔗糖密度梯度离心法纯化出流感病毒,病毒原液经纯化后被分离成L、M、H三个病毒带,其中M病毒带的吸光度、蛋白浓度及血凝滴度最高,蛋白浓度可达1.2mg/mL,血凝滴度高达1×49。电镜观察显示,L区带为具有血凝活性的质膜和结构疏松的病毒组成,M区带病毒颗粒呈球形、丝状或棒状。同时,有大量空心病毒颗粒存在。H区带与M区带类似,但未发现空心病毒颗粒。纯化的病毒免疫小鼠后可产生具有较高血凝抑制活性的抗体。结论蔗糖密度梯度离心技术可用于流感病毒抗原的制备,且不影响病毒的免疫原性。因此,密度梯度离心法可为流感病毒的基础研究及疫苗开发提供技术支持。