蔗糖磷酸化酶的异源表达及合成蜜二糖条件优化

为挖掘蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase,SPase)合成蜜二糖的潜力、降低蜜二糖制备的工业成本,该研究利用大肠杆菌对SPase基因进行异源表达,通过镍柱纯化后表征其酶学性质,采用响应面试验优化合成蜜二糖的最佳反应条件,成功将芒果源肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的SPase基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得可溶性SPase。酶学性质研究结果表明其比酶活为78 U/mg,最适反应温度和pH值分别为40℃和6.0。以此为基础利用SPase进行蜜二糖的合成优化,结果表明,在40℃条件下,添加200 g/L蔗糖、400 g/L D-半乳糖和390 U/L的SPase,反应24 h最高可获得浓度为(34.20±0.92)g/L的蜜二糖。

长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶的异源表达及其酶学性质

为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSPase)合成2⁃O⁃α⁃D⁃吡喃葡糖基⁃L⁃抗坏血酸(2⁃O⁃α⁃D⁃glucopyranosyl⁃L⁃ascorbic acid,AA⁃2G)的潜力,该研究将BloSPase基因在大肠杆菌中异源表达,以BloSPase的水解酶活力为指标,通过单因素试验和响应面法对其表达条件进行优化;并通过镍柱纯化后对其转糖基化活力进行研究。结果表明,BloSPase的最佳表达条件为诱导时间10 h、异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷(isopropylthio⁃β⁃D⁃galactoside,IPTG)浓度0.47 mmol/L、诱导温度23℃。在该条件下,水解酶活力可达到(730.35±0.58)U/mL,比酶活达到(95.22±2.45)U/mg。酶学性质研究显示,BloSPase转糖基化活力的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.2,在40、50℃时表现出较强的热稳定性。其动力学参数Km值为(266.80±23.76)mmol/L,Vmax值为(0.2350±0.0099)mmol/(L·min)。

蔗糖磷酸化酶制备及应用的研究进展

蔗糖磷酸化酶作为一种葡萄糖基转移酶,具有广泛的底物特异性,能够催化合成α型熊果苷、低聚糖等多种物质,在食品、化妆品、医药行业具有广泛的应用。该文综述了蔗糖磷酸化酶的结构等生化特性及其催化特性,并介绍了目前高产蔗糖磷酸化酶的主要生产菌株,以及该酶的应用及市场前景,并结合国外研究的热点及其研究进展,提出了国内开展课题研究方向。

巴西橡胶树磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表达模式分析

蔗糖是橡胶生物合成的主要碳源,而磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,克隆橡胶树SPP家族基因并研究其表达特性,将有助于揭示橡胶树中蔗糖合成代谢的分子调控。本研究利用拟南芥和杨树的SPP氨基酸序列为探针,搜索橡胶树EST和基因组数据库,并设计引物进行PCR扩增,得到1个橡胶树SPP基因的cDNA和基因组序列,命名为HbSPP1。序列分析显示,HbSPP1基因组含有8个外显子、7个内含子,其cDNA序列的编码区(CDS)为1 278 bp,编码424个氨基酸,蛋白分子量为48.1 ku,等电点为6.02。进化上,HbSPP1基因与杨树SPP基因的亲源关系比拟南芥要近。组织特异性表达分析发现,HbSPP1在叶片中的表达丰度最高。另外,在叶片不同发育阶段中,HbSPP1在稳定期叶片中的表达明显低于幼期叶片。

巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶的分离鉴定

对巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶进行了分离鉴定。结果表明,该酶催化可逆反应,分子量大小约为56 kDa,最适pH值为7.5,最适温度为50℃。为利用巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508以蔗糖为原料直接合成蔗糖-6-乙酸酯提供了新的研究思路。

巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶生物催化合成α-熊果苷的研究

利用巨大芽孢杆菌Bacillus megateriumNCIB 8508蔗糖磷酸化酶生物催化合成α-熊果苷。考察了缓冲溶液pH值、缓冲溶液浓度、对苯二酚浓度、反应物摩尔比及反应时间等因素对反应的影响。结果表明,以湿菌体50 mg.mL-1破碎细胞粗酶液催化合成α-熊果苷,在pH值为6.5的30 mmol.L-1磷酸盐缓冲溶液中,温度为30℃、摇床转速为180 r.min-1、对苯二酚浓度为5 mmol.L-1、对苯二酚与蔗糖摩尔比为1∶5、反应时间为24 h的优化条件下,α-熊果苷含量达0.35 mg.mL-1、对苯二酚选择性为4.0%、对苯二酚转化率为74%。

肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因在大肠杆菌中的表达

以肠膜明串珠菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到1 581 bp的蔗糖磷酸化酶(SPase)DNA片段。将该基因克隆到表达载体pET-22b(+)上,构建获得重组质粒pET-SPase。测序结果与GenBank上已公布的基因序列比较,有1个碱基发生变化,但该碱基的改变未引起氨基酸序列的改变。将pET-SPase转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态中,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,目的蛋白条带约为55 kD,与预期大小一致,结果表明SPase基因在大肠杆菌中进行了表达。酶活分析,产物的比活为1.8 U/mg,证明了表达产物具有预期的酶活性。进一步考察了IPTG浓度、诱导温度和时间等因素对重组菌表达的蔗糖磷酸化酶的影响。在优化条件下,该蔗糖磷酸化酶的比活可以达到16.6 U/mg,比优化表达条件前的酶比活提高了9.2倍,比已报道的肠膜明串珠菌粗酶液比活(7.1 U/mg)提高了2.34倍。

蔗糖磷酸化酶的分离纯化及其催化合成α-熊果苷的研究

考察了肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)G123厌氧发酵产蔗糖磷酸化酶下游的分离纯化工艺。收集的菌体经超声破碎得到粗酶液,通过硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析分离后获得了电泳纯的蔗糖磷酸化酶,酶活回收率为31.7%,酶的分子量约为55.7 kD,纯化后的蔗糖磷酸化酶比活为115.3 U/mg。该酶在中性及偏酸性(pH5.5-8.0)情况下,酶稳定性较好,较报道的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-1149的pH稳定范围宽。同时该酶在37℃保存2 h,酶活几乎没有下降。利用获得的纯酶以氢醌和蔗糖为底物催化合成α-熊果苷,在23 U/mL的酶反应体系中,60%蔗糖、5%氢醌、pH7.5,37℃,反应12 h,氢醌转化率达到16.3%,α-熊果苷的产量为20g/L。

马铃薯不同品种淀粉积累生理基础研究——淀粉积累与磷酸化酶、蔗糖转化酶的关系

本试验以高淀粉品种晋薯２号、中淀粉品种内薯３号、低淀粉品种紫花白为材料，对不同生育时期块茎淀粉含量、淀粉积累速度与淀粉磷酸化酶、蔗糖转化酶活性的关系进行了研究，其结果表明：全生育期３个品种淀粉磷酸化酶活性均呈单峰曲线变化；不同生育时期，各品种淀粉含量与淀粉磷酸化酶活性无明显规律性；不同生育时期，各品种淀粉积累速度与淀粉磷酸化酶活性呈正相关。淀粉含量和温度是影响淀粉磷酸化酶活性的两个重要因素，而温度又起主导作用。全生育期，３个品种的蔗糖转化酶均呈苗期为最高，中期显著下降，后期略有回升的变化趋势；不同生育时期，各品种淀粉含量与蔗糖转化酶活性均呈显著负相关；不同生育时期，各品种淀粉积累速度与蔗糖转化酶活性亦呈负相关。因此，蔗糖转化酶活性可作为马铃薯高淀粉育种早期选择的重要生理指标。

肠膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶的酶学性质及转糖苷分子改造

根据GenBank数据库公布的肠膜明串珠菌ATCC 12291中蔗糖磷酸化酶基因序列,构建重组表达质粒pQE-lmsp.在大肠杆菌Escherichia coli M15/pREP4中诱导表达,镍亲和层析纯化蛋白,进行酶学性质测定和重组酶转糖苷活性的研究.以蔗糖为底物对LMsp进行酶学性质分析,其最适温度和最适pH值分别为40℃和6.5;Km值和Vmax值分别为(34.16±1.219)mmol/L和(370.5±6.049)μmol/(mg·min).当以葡萄糖-1-磷酸为供体时,对于大多数单糖及其糖醇类受体均具有转糖苷活性,尤其对L-阿拉伯糖具有75%的转化效率.然后通过对LMsp进行同源建模和氨基酸序列比对分析,进行分子改造,并比较酶学性质及转糖苷活性的变化.获得7个单点和联合的突变体T180A、T219V、P236S、T180A-T219V、T180A-P236S、T219V-P236S、T180A-T219V-P236S,其中突变体T180A、P236S对L-山梨糖的转糖苷活性分别有13.7%和15%的提高.本研究通过对LMsp的研究,发现其具有良好的酸碱稳定性和对L-阿拉伯糖的高转糖苷活性,并且获得了对于L-山梨糖转糖苷活性提高的突变体,丰富了有关于蔗糖磷酸化酶的性质,并且对该酶的分子改造提供了经验依据.

Clostridium butyricum蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其功能研究

本研究克隆表达丁酸梭菌Clostridium butyricum DSM10702菌株的蔗糖磷酸化酶基因,并探究重组酶的酶学性质和转糖苷功能。从丁酸梭菌C.butyricum DSM10702菌株中克隆蔗糖磷酸化酶基因cbsp,构建重组表达质粒pQE30-cbsp并在大肠杆菌Escherichia coli XL1-blue中诱导表达;将重组蛋白经镍柱纯化后,进行酶学性质和转糖苷功能研究。实验结果表明,以蔗糖为底物,重组酶Cbsp的最适温度为45℃、最适pH为7.0、V_(max)和K_(m)分别为(957±23.29)μmol·mg^(-1)·min^(-1)和(62.4±4.749) mmol·L^(-1)。当以葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)为糖基供体时,重组酶Cbsp对于多数单糖、糖醇类、(-)-儿茶素、己基-β-D-吡喃葡萄糖苷和L-抗坏血酸表现出转糖苷活性。以上研究结果可丰富蔗糖磷酸化酶相关数据库,为其应用研究提供参考。

重组蔗糖磷酸化酶表达培养基的优化及化学试剂对酶活的影响

为了提高重组蔗糖磷酸化酶的表达水平,本研究通过单因素实验,研究了不同的碳源、氮源、稳定剂和金属离子对重组蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中表达的影响,并通过正交试验确定了最优的重组蔗糖磷酸化酶表达培养基的成分。另外,本研究也考察了不同的化学试剂和金属离子对重组蔗糖磷酸化酶的活性影响。结果表明,维生素C和FeCl_(2)显著(P<0.01)抑制了蛋白的表达,Cu^(2+)和Zn^(2+)完全抑制了菌体的生长,而淀粉、K+和Mg2+对重组蔗糖磷酸化酶的表达具有一定的促进作用,且三者的协同作用可以极大的提高重组蔗糖磷酸化酶的表达效率。其中在50 mL LB培养基中加入0.5%淀粉、0.1%K^(+)和0.05%Mg^(2+)的组合,总酶活达1207.83 U,比优化前提高了3.6倍。,Fe^(2+)(10 mmol/L)、Mg^(2+)(10 mmol/L)、牛血清蛋白(1%)和土温80(0.1%)均可在一定程度上提高该酶的活性。

蔗糖磷酸化酶的半理性设计及生产α-熊果苷的条件优化

α-熊果苷是一种高价值糖苷,在化妆品和制药行业具有广泛的应用前景。酶法是生产α-熊果苷的主要手段,但由于缺乏高催化效率的酶而限制了α-熊果苷的生产。为了提高来自Streptococcus mutans UA159的蔗糖磷酸化酶(SmSP)的生物转化效率,进而提高α-熊果苷的产量,筛选了4种在Bacillus subtilis WB600中表达SmSP的载体,其中重组质粒pP43NMK-P43-gtfA在全细胞转化20 h后获得了最高的α-熊果苷产量(40.2 g/L)。其次,对SmSP催化活性中心周围的loop A进行了定点饱和突变,以提高酶和受体之间的亲和力,得到了突变体SmSP^I336L,其α-熊果苷产量和底物对苯二酚(hydroquinone,HQ)摩尔转化率分别为71.7 g/L和72.4%,产量相比对照提高了78.4%。最后,对重组菌株B.subtilis WB600/pP43NMK-P43-SmSP^I336L全细胞转化合成α-熊果苷反应条件进行优化,α-熊果苷的产量达到了110.3 g/L,HQ摩尔转化率为88.7%,产量相比对照提高了2.74倍。高催化效率重组菌株的构建,以及对突变体动力学的分析,对生物转化合成α-熊果苷具有重要的研究意义和应用价值。

蔗糖磷酸化酶产生菌的筛选及其催化合成α-熊果苷条件优化

以来宾甘蔗地土壤为菌源,分离筛选出一株能高产蔗糖磷酸化酶的菌株SLLSM2,经过16S rDNA鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);以其为出发菌株对其产酶条件进行单因素试验和响应面试验优化,之后对此酶催化合成α-熊果苷条件进行优化。结果表明,最优产酶条件为蔗糖含量7.5%,蛋白胨含量9.0%,接种量10%,pH 6.0,发酵96 h。在此优化条件下蔗糖磷酸化酶酶活由原来的23.12 U/mL提高到了120.07 U/mL,比优化前提高了5.19倍。此酶催化合成α-熊果苷的最优条件为:酶添加量150 U,氢醌浓度4%,反应温度45℃,pH6.0,在最优条件下,α-熊果苷合成摩尔转化率达44.09%。

细菌产生的蔗糖磷酸化酶的筛选及其特性

蔗糖磷酸化酶(SPase)能催化蔗糖磷酸化,生成α-D葡萄糖-1-磷酸脂(G-l-P)和D-果糖,此催化反应是一个可逆反应.该酶是一种葡糖基转移酶,能转移蔗糖葡糖基和G-l-P到P_1以及包括D-果糖在内的一些糖.已有报道来源于肠膜明串珠菌ATCC12291是以糖、酒精和酚的化合物作为糖基受体.除来源于肠膜明串珠菌的蔗糖磷酸化酶外,其它蔗糖磷酸化酶已用于P_1的酶促实验与各种酶促萄糖基化的作用中.

肠膜样明串珠菌B-1149中蔗糖磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

分离和鉴定了肠膜样明串珠菌NRRL B-1149的蔗糖磷酸化酶（SPase）基因1149sp。它由1479bp的核苷酸构成，编码了1149 SPase的492个氨基酸残基，分子量为56．1k。该基因具有独特的C端氨基酸序列（^439DVETPSDTHKITRKDKSGENVAVLVANA ADKTFTITANGEEILANTEADKQQL^492）。在大肠杆菌中表达1149sp，纯化的1149 SPase对蔗糖的比活力为1．49IU／mg。SPase在宽泛的反应温度和pH范围内均有活性，分别为20～50℃，pH6．0～7．5。最适温度和pH分别为37℃和6．7。1149 SPase对底物蔗糖的米氏常数Km为6．3mmol／L，催化速度常数放。是1．59s^-1。其具有宽泛的受体特异性，能将蔗糖的部分葡萄糖基或葡萄糖-1-磷酸转移至多种受体。

蔗糖磷酸化酶全细胞催化AA-2G的条件优化

目的:使用表达蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-spase,作为全细胞催化剂,合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)。通过反应条件的优化研究,提高AA-2G的收率。方法:分别考察菌体量、缓冲液pH、蔗糖浓度、维生素C浓度、反应时间和温度对AA-2G合成反应的影响,再组合上述最佳条件进行反应。AA-2G的产量使用高效液相色谱法进行定量。结果:最佳反应条件为:菌体量15 mg/mL,缓冲液pH 4.5,蔗糖浓度100 g/L,维生素C浓度175 g/L,反应时间20 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G产量达到了35.7 g/L。结论:以蔗糖为底物,使用SPase合成AA-2G的研究报道较少。本研究通过优化此方法的反应条件,让AA-2G的产量得到了大幅提高。同时本研究中成功地采用了大肠杆菌工程菌作为全细胞催化剂,这比传统的使用粗酶液的方法更省时省力,有良好的应用潜力。

以蔗糖为底物双酶法合成直链糊精

选用蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶合成直链糊精,并对工艺条件进行优化。以蔗糖为底物,在添加磷酸盐的条件下,蔗糖磷酸化酶催化反应,生成中间产物葡萄糖-1-磷酸,选用液质联用仪鉴定葡萄糖-1-磷酸的产生;加入麦芽四糖作引物,葡聚糖磷酸化酶催化合成直链糊精,用高效离子交换色谱分析终产物直链糊精的聚合度分布。通过单因素实验,分别研究酶浓度、反应时间、pH及温度对两步反应的影响。蔗糖磷酸化酶催化生成中间产物葡萄糖-1-磷酸的优化工艺条件为:酶浓度4.0 U/mL、反应时间4 h、pH 6.5、温度40℃;葡聚糖磷酸化酶催化合成直链糊精的优化工艺条件为:酶浓度5.0 U/mL、反应时间4 h、pH 4.5、温度40℃。

重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成α-熊果苷

利用重组大肠杆菌EscherichiacoliRosetta（DE3）／pET-SPase发酵生产蔗糖磷酸化酶（EC2．4．1．7，Sucrosephosphorylase，SPase）。收集的菌体经高压破碎后离心得到粗酶液，通过镍NTA亲和层析、超滤除盐后得到电泳纯的SPase，纯化后的SPase的比酶活是原来的2．1倍，酶活回收率达到82．7％。经SDS．PAGE电泳测定，重组SPase的分子量约为59kDa。该酶在不高于37℃，pH6．0～6．7的条件下比较稳定，最适催化温度与最适催化pH分别为37℃，pH6．7，该酶对蔗糖的米氏常数（Km）为7．3mmol／L，最大反应速率（Vmax）为0．2／μmol／（min·mg）。此外文中还以蔗糖和氢醌为底物，利用重组SPase催化合成a-熊果苷。其最佳反应条件为：20％蔗糖，200U／mL的酶液，1．6％氢醌，pH6．0～6．5，25℃，反应21h。a-熊果苷的摩尔产率为78．3％，a-熊果苷的产量为31g／L。

肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的酶学表征及在催化合成α-熊果苷中的应用

将来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,SPase)基因进行密码子优化后将其插入到pET-28a中构建表达载体pET-28a-spase,诱导大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-spase表达制得SPase粗酶液,将重组SPase纯化后进行酶学表征。结果表明,重组SPase的比酶活为213.98 U/mg,纯化倍数为1.47倍,酶活回收率达87.80%。该酶最适温度为45℃,最适pH为6.5,该酶对蔗糖的Km为128.8 mmol/L,Vmax为2.167μmol/(mL·min),kcat为39237.86 min^-1,利用重组SPase催化氢醌合成α-熊果苷,最优条件为:氢醌添加量为40 g/L,蔗糖/氢醌的摩尔比为5:1,重组SPase 250 U/mL。在25 mmol/L的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(pH 7.0)中,反应温度30℃,避光反应24 h后终止反应,再用500 U/mL的糖化酶40℃处理2.5 h。α-熊果苷产量达98 g/L,氢醌的转化率接近99%。综上所述,文中克隆并研究了重组SPase,并建立了其在α-熊果苷生产中的应用。