淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因的克隆

微囊藻毒素去毒酶在鱼类微囊藻毒素去毒过程中起着关键作用,研究成功克隆鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲫鱼、鳜鱼、罗非鱼等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心片段而首次获得这些淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶氨基酸序列。鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲫鱼、鳜鱼、罗非鱼微囊藻毒素去毒酶基因与人、小鼠、大鼠、牛、猪、羊的谷胱甘肽S-转移酶基因氨基酸同源性为60%左右,表明淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因在进化上变异性较大,与其承担微囊藻毒素去毒代谢之特殊功能相适应。

微囊藻毒素去毒酶转基因模型的构建

根据已克隆的鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)微囊藻毒素去毒酶cDNA全序列设计特异引物,利用PCR方法获得鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因编码区,将该编码区与绿色荧光蛋白连接,分别构建融合表达载体pEGFP-N1-sGST和双顺反子表达载体pIRES2-EGFP-sGST。利用脂质体转染法将融合表达载体pEGFP-N1-sGST转染Hela细胞,60h后检测到绿色荧光基因表达;通过显微注射,将双顺反子表达载体pIRES2-EGFP-sGST注入斑马鱼(Daniorerio)受精卵,获得了转鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因斑马鱼,从而构建了微囊藻毒素去毒酶转基因模型。上述2种转基因模型的成功构建为进一步研究鲢鱼、鳙鱼(Aristichthysnobilis)、罗非鱼(Oreochromisnilotica)等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因调控元件、去毒分子机理及研发转基因鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼等微囊藻毒素高效生物去毒器奠定了基础。

藻毒素对鱼类肝脏的毒理学效应

以鱼类肝脏为靶器官,研究了藻毒素对鱼类的毒性影响.结果表明,藻毒素在注射和口服两种不同的染毒方式下,均可引起受试鱼类发生急性中毒死亡.对中毒鱼类进行解剖分析发现,受试鱼类的肝/体重比高于对照组.说明无论哪种给药方式,藻毒素都会迅速地、专一地作用于鱼类肝脏,引起鱼类肝脏充血红肿,出现血斑.通过对鱼类肝脏组织碱性磷酸酶(ALP)同功酶谱的分析,可以发现在两种不同染毒条件下藻毒素各剂量组的ALP同功酶谱与对照组相同,均有ALP1～ALP55条带,只是高剂量组较低剂量组ALP1～ALP3 3条带的着色深,并可使ALP同功酶各组分的相对活性上升.试验结果显示,藻毒素具有极高的细胞选择性和专一生物活性,其在生物机体内所引发的许多细胞学变化主要是对生物体肝脏酶系统的破坏所致,必须引起人们的重视.

太湖微囊藻毒素与湖泊物理因素之间的关系

应用酶联免疫吸附法(ELISA)监测了太湖2001年的微囊藻毒素的周年变化,探讨了微囊藻毒素浓度(Microcystin-LR,MCLR)和水温、光照、悬浮质、溶解氧、风浪等湖泊物理因素之间的关系,显示微囊藻毒素在夏秋季节较高,但各采样点微囊藻毒素浓度的最高值及其变化趋势与各采样点所处地理位置,水动力学变化及样点周围水域藻类生长情况等有密切关系,从湖泊物理因素来看,微囊藻毒素浓度受风浪和水温的影响较大。

高效液相色谱用于微囊藻毒肽的分离制备

<正> 微囊藻是有毒藻类之一。微囊藻毒素结构复杂,多为肽类,在药理学性质上具有典型肝毒特征。中科院水生所曾对武昌东湖和安徽巢湖的微囊藻毒素作了初步研究并证明为毒肽。为了对此毒肽作进一步结构分析,本文采用反相高效液相色谱对该毒肽进行了纯化制备,取得了色谱纯单峰样品供小白鼠毒性实验,证明其具有与文献报道相符毒性。 本文还考察了流动相中有机改性剂的比例和离子强度对毒肽容量因子(k~′)的影响,并探讨了毒肽在反相键合固定相上的双保留机理。

利用real-time RT-PCR研究大型蚤对铜绿微囊藻毒素合成基因转录水平影响

近年来关于浮游动物与微囊藻相互作用的研究逐渐被关注,其中有的研究认为浮游动物能够诱导产毒细胞毒素含量的变化.微囊藻毒素是由微囊藻毒素合成基因编码翻译的,目前关于浮游动物对微囊藻毒素合成基因相对表达的影响并无报道,本文首次通过实时定量逆转录PCR方法研究铜绿微囊藻PCC7806产毒相关基因mcyB和mcyD在大型蚤胁迫下相对表达变化.结果显示微囊藻mcyB、mcyD基因相对表达均有上调,表明铜绿微囊藻PCC7806通过上调产毒基因的转录水平达到对大型蚤的诱导防御,从而为浮游动物与微囊藻相互作用研究提供新的依据.

鳙鱼微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列的克隆与序列分析

淡水鱼类可溶性谷胱甘肽S-转移酶(soluble glutathione S-transferase,sGST)在微囊藻毒素去毒代谢过程中起着关键作用,又被称为微囊藻毒素去毒酶．通过简并引物克隆鳙鱼肝脏sGST基因cDNA核心序列,应用5’-RACE和3’-RACE技术分别扩增该序列的5’末端和3’末端序列,最后通过序列拼接获得鳙鱼肝脏sGST基因cDNA全序列．序列分析结果表明,鳙鱼肝脏sGST基因cDNA全长934 bp,其中5’-UTR长104 bp,3’-UTR长158 bp,编码区672 bp,编码223个氨基酸．鳙鱼与海水鱼类、鸟类、哺乳类等不同类群sGST的N-末端功能域氨基酸同源性较高,达75％左右,而C-末端功能域氨基酸同源性较低,仅为43．6％-55．9％,这与脊椎动物sGST的N-末端功能域均存在相同的GSH结合位点,而C-末端功能域存在不同的底物结合位点相一致．鳙鱼sGST的C-末端功能域的低同源性可能与其承担微囊藻毒素去毒代谢之特殊功能有关．

华南热带水库拟柱孢藻产毒基因型的低优势及影响因子分析——以珠海市水库为例

研究以珠海市20座水库两次(2018年和2022年)调查数据为基础,分析华南热带地区产毒拟柱孢藻的发生规律和拟柱孢藻毒素(CYN)的健康风险。基于rpoC1和cyrJ基因的荧光定量PCR分析发现,在两次采样的40个样品中均检到拟柱孢藻,在其中的33个样品中检到产毒拟柱孢藻。种群内产毒基因型的比例在0.046%—38.66%,表明产毒株广泛存在但不占优势。与2018年相比,20座水库的总拟柱孢藻丰度均值在2022年增加近10倍,但两年的产毒拟柱孢藻丰度无显著差异;产毒基因型的比例明显下降,比例均值和最大值分别从2018年的14.86%和38.66%降至2022年的4.17%和17.24%;CYN浓度与产毒细胞比例具有类似的变化趋势,平均浓度也从0.56降至0.19μg/L。线性混合效应模型分析表明,非产毒基因型丰度随无机磷的升高及硝氮的下降而显著增加,而产毒拟柱孢藻比例随水温升高而增加。

阴离子表面活性剂LAS对产毒和无毒微囊藻生长及产毒特性的影响

文章研究了低浓度范围内不同浓度梯度的阴离子表面活性剂直链烷基苯磺酸盐(LAS)对产毒微囊藻(Microcystis aeruginosa,FACHB905)和无毒微囊藻(Microcystis wesenbergii,FACHB908)生长、光合特性、种间竞争及毒素合成的影响。结果表明,在0.05-5.0 mg/L LAS浓度梯度处理下,产毒微囊藻的生物量、产毒基因mcyD表达量和每细胞MCs含量均在培养12d后显著增加。产毒微囊藻胞内和胞外MCs含量在各LAS浓度处理后分别为0.069、0.052、0.061、0.038和0.037 fg/fg Chl.a及107.1、103.7、127.1、99.6和113.7 ng/L。即使在0.5 mg/L低浓度LAS处理条件下,上述3个参数也分别比对照组显著增加了24.2%、12.4倍和10.4%。浓度为0-0.2 mg/L LAS对无毒微囊藻的生物量无明显影响,而较高浓度的LAS(0.5-5.0 mg/L)明显抑制了无毒微囊藻的生长。在两株微囊藻混合培养时,0.2-1.0 mg/L LAS处理组的产毒铜绿微囊藻mcy D的表达对LAS响应迅速,使得产毒微囊藻占总微囊藻的比例高达60%-80%,明显高于对照组。但其MCs合成和释放速度缓慢,在混合培养12d后才开始大量合成并释放微囊藻毒素,此时胞内MCs含量分别为0.098、0.184、0.201、0.216、0.168和0.241 fg/fg Chl.a。总体上,研究表明LAS对产毒微囊藻的生长和毒素合成具有促进作用,因此,在富营养化水体中LAS污染对产毒微囊藻优势的形成及水华综合毒性的潜在影响不可忽视。

基于UPLC-Q-ExactiveMS构建麻痹性贝类毒素的特征指纹溯源技术

麻痹性贝类毒素污染是世界共同关注和重点管控的食品安全问题,其溯源一直是产业监管的难点和技术重点。基于指纹溯源技术理论,采用室内模拟3种产毒藻暴露紫贻贝后风险形成过程,开发基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive MS)鉴定麻痹性贝类毒素区域特征的指纹溯源技术。结果表明,采用乙腈/甲醇/丙酮(体积比为1︰1︰1)混合溶液作为提取剂,C8色谱柱联合正离子模式,质荷比(m/z)100~600和Amide色谱柱联合正离子模式,m/z 600~1500作为色谱质谱检测条件下,提取的化合物数量较多且稳定性良好,覆盖了40.4%指纹信息;紫贻贝与产毒藻中的共检出11种毒素成分,且具有高度相关性。N-磺酰胺甲酰基类毒素(如C类)和膝沟藻毒素(GTX类)在暴露期发生了显著的代谢转化;将摄食3种产毒藻后紫贻贝的差异化合物与特征毒素组分进行主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析,共筛选出13种复合指纹物质。构建6种特征物质的Fisher判别模型,交叉验证准确率为88.9%,可实现产毒藻种溯源。该研究建立了基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱UPLC-Q-Exactive MS紫贻贝特征指纹溯源技术,初步实现了从污染麻痹性贝类毒素的贝类到肇事藻种的逆向溯源,可应用于贻贝麻痹性贝类毒素风险溯源研究。

滇池水华蓝藻干粉制剂的生物脱毒实验

滇池属长江流域的一个内陆湖泊 ,近年来水体富营养化日益严重 ,每年夏季都出现大面积的水华。但品种单一 ,主要为蓝藻门 ,其中微囊藻是优势种 ,产生的微囊藻毒素具有很强的毒性。本实验以富营养化湖泊滇池中的水华蓝藻作为主要原料 ,将其制成干粉后 ,利用双协菌株在 2 8～ 3 2℃条件下对其进行固态发酵 ,培养基质初始水份为 65 %。发酵培养 2d后 ,培养基质中微囊藻毒素含量明显降低 ,6d后 ,基质中微囊藻毒素含量未检出 (最低浓度检测限 1μg/mg)。同时对实验所获得时间序列进行动力学研究 。

洱海水华期间饮用水源区产毒微囊藻和微囊藻毒素-LR的分布特征

水华期间微囊藻毒素的释放会严重影响洱海饮用水源水质安全.应用荧光定量PCR结合酶联免疫法快速检测洱海水华高发秋季(8—11月)主要旅游区和饮用水源地产毒微囊藻丰度和微囊藻毒素LR浓度.结果表明,荧光定量PCR方法能够快速定量洱海中总微囊藻种群和产毒微囊藻丰度,并且能有效预测洱海水体产毒潜能.洱海总微囊藻平均丰度为8.15×10~6copies·L^(-1),9月份均值最高,产毒微囊藻平均丰度为6.42×10~5copies·L^(-1),也于9月达到最高值,占总微囊藻的比例为1.0%~69.8%,水温和TP显著影响洱海总微囊藻丰度,低温、低P是洱海微囊藻水华的限制因子.洱海毒素峰值期为10月上旬,期间水源地微囊藻毒素和胞外微囊藻毒素全部检出,叶绿素a显著影响总微囊藻毒素和胞外微囊藻毒素分布,说明在一定程度上Chl a值能预测水体微囊藻释放的毒素风险.洱海总微囊藻毒素LR最高值达2.17μg·L^(-1),已超过集中式生活饮用水地表水源地对MC-LR的限值(1.0μg·L^(-1)),表明水华期间洱海饮用水水源安全问题不容忽视.

太湖梅梁湾水华微囊藻基因型组成和产毒微囊藻丰度的变化

采用基于ITS序列的PCR-DGGE方法分析了太湖梅梁湾水华暴发过程中(6-11月)微囊藻的不同基因型组成的变化,同时利用针对微囊藻毒素合成酶基因mcyA和微囊藻特异性的16SrDNA部分核苷酸序列的引物,应用实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)分析水华样品中产毒微囊藻与总微囊藻的量,通过两者的比值反映产毒微囊藻丰度.结果表明,在发生水华的不同时期,微囊藻的基因型组成发生了变化,其中以8月末、9月和10月的基因型最多,基因型M5和M10存在于整个水华发展过程中.共检测到12种主要的基因型,每个基因型在水华的不同时期所占的比例互不相同.实时荧光定量PCR结果显示从6月到10月,产毒微囊藻的丰度呈增大的趋势,从0.75%增加到32.16%,而11月产毒微囊藻的丰度显著下降.

实时荧光定量PCR方法检测南太湖入湖口产毒微囊藻

南太湖入湖口产毒微囊藻的丰度对于周边县市取水口的水质安全和太湖水质有着重要影响.以藻毒素合成酶基因mcyE/ndaF为靶基因,建立实时荧光定量PCR检测产毒微囊藻的方法,并对南太湖入湖口7个监测点水样中产毒微囊藻的丰度进行检测,结果表明:该实时荧光定量PCR方法的特异性强及准确性、重复性较好.建立铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的标准曲线方程为y=-3.454x+49.88,斜率为-3.454,R^2=0.991,扩增效率E为94.6%,定量检测区间为1.689×10~4~1.689×10~8拷贝数/μl.对南太湖入湖口7个监测点检测表明,夹浦和合溪2个监测点的产毒微囊藻数量最高,预测产毒微囊藻浓度分别为(1.99±0.35)×10~5和(1.47±0.23)×10~5cells/ml.7个监测点的产毒微囊藻的种类较为一致,均为铜绿微囊藻.该方法可以快速准确地检测水体中微囊藻毒素产毒藻种种类和数量,为蓝藻水华监测、预警提供技术依据.

利用PCR方法研究广州市景观湖产毒微囊藻的季节分布特点

为研究景观水体中产毒微囊藻的季节性分布特点,利用针对蓝藻和微囊藻的16 srDNA、微囊藻毒素合成酶 mcyB 基因的部分核苷酸序列设计和筛选的特异性引物,对广州市内8个景观湖108份水样进行了冬季、夏季和秋季的二重及套式PCR的检测。结果显示,在冬季能被检测出的产毒微囊藻的阳性水样为42份,夏季为102份,而秋季为100份;阳性率分别为38.9%、94.4%、92.5%,产毒微囊藻在夏季和秋季阳性率高。结果表明在冬季、夏季和秋季均有产毒微囊藻分布;夏、秋季是广州市景观水体微囊藻污染的高峰季节,值得引起水文部门足够的重视。

麻痹性贝毒毒素(PSP)及其产毒藻对海洋鱼类危害的研究

麻痹性贝毒毒素(PSP)是海洋赤潮藻毒素中分布最广、危害最严重的一种藻毒素,是甲藻等有毒藻产生的一类四氢嘌呤毒素的总称。近年来的研究表明,PSP对鱼类有强烈的致死作用。海洋鱼类除了受到PSP及其产毒藻的急性毒性影响而死亡外,在受到非致死性的毒性作用时,鱼的其它生理状态也会发生一定的变化:如酶活性增加或降低、细胞坏死脱落以及鱼的行为改变等。

产毒微囊藻PCR检测方法的建立

[目的]建立产毒微囊藻的PCR检测方法。[方法]根据GenBank上发表的mcyA基因序列保守区域设计一对引物,建立和优化检测产毒微囊藻的PCR方法,并以此方法检测产毒和非产毒微囊藻参考株系。[结果]经PCR检测,产毒藻株出现特异性扩增条带,而不产毒株未出现特异性条带;以10倍系列稀释纯培养的蓝藻细胞作为PCR反应的模板,检测限均为2.46×103细胞/ml;运用建立的方法从天然水体中检测到了产毒微囊藻,对PCR产物序列进行比对,发现PCR扩增片段与铜绿微囊藻(PCC7806)核苷酸序列的同源性为98%。[结论]该研究为水华产毒微囊藻的监测提供了一种新方法。

产毒微囊藻基因型及胞内外毒素含量的SVM预测

根据2021年5-8月淡水养殖池塘3个平行位点逐月实测数据,文章构建了基于支持向量机(SVM)的产毒微囊藻SNP/InDel基因型及胞内外毒素含量的预测模型。分析了各水化指标与产毒微囊藻6种基因型及胞内外毒素含量的相关系数,对原始数据归一化,以径向基函数为核函数,通过5折交叉验证确定模型最优参数,建立了用水化指标预测产毒微囊藻6种基因型的6个模型,以及用水化指标、6种基因型预测胞内外毒素含量的2个模型。结果表明:每项水化指标都至少与1种产毒微囊藻基因型或1项毒素含量的相关系数大于0.3。在8个预测模型中,对训练集预测的均方误差均小于0.07,对训练集预测的决定系数均大于0.9,平均的测试集均方误差为0.054。可见,利用SVM预测养殖池塘中产毒微囊藻SNP/InDel基因型及胞内外毒素含量是可行的,且精度较高。

基于三维荧光的产麻痹性贝毒藻浓度监测研究

近年来,我国沿海赤潮发生的次数和面积持续增加,经济损失严重。根据赤潮的毒性特点,通常分为三类,分别为无毒赤潮、鱼毒性赤潮和有毒赤潮。其中有毒赤潮产生的毒素主要是麻痹性贝毒,其由于分布广,毒性强成为危害最大的生物毒素之一。根据麻痹性贝毒的摄入量不同,人类误食染毒的贝类后,身体各部位会出现刺痛或灼热的感觉,然后全身麻痹,严重者甚至在短时间内死亡。近年来,多地出现人类误食染毒的贝类后死亡的事件。麻痹性贝毒的摄入量主要取决于产麻痹性贝毒藻的浓度,因此,对产麻痹性贝毒藻浓度的监测就显着尤为重要。提出了用三维荧光光谱结合化学计量学方法建立产麻痹性贝毒藻定量分析模型。首先,利用F-4600荧光光度计采集微小亚历山大藻(Alexandrium minimum)、链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)和太平洋亚历山大藻(Alexandrium pacificum)三种典型的产麻痹性贝毒藻类三维荧光光谱数据,获取藻类样本的三维荧光光谱等高线图,并进行图谱分析;然后,利用不同激发波长下的发射光谱数据建立产麻痹性贝毒藻三维荧光光谱的串行表示模型,提取新的特征;最后,将新的特征数据分别作为粒子群优化最小二乘支持向量机算法(particle swarm optimization-least squares support vector machine, PSO-LSSVM)和偏最小二乘回归(partial least squares regression, PLSR)的输入,建立产麻痹性贝毒藻的定量分析模型。结果表明,运用粒子群优化最小二乘支持向量机算法建立的产麻痹性贝毒藻的定量分析模型普遍优于偏最小二乘回归算法。当激发波长选择460和530 nm,发射波长选择650~750 nm作为PSO-LSSVM的输入数据,建立的产麻痹性贝毒藻的定量分析模型效果最好,结果显示Rc=0.999 9, RMSEC=0.017 1,Rp=0.949 2, RMSEP=0.291 0。这体现出三维荧光光谱结合PSO-LSSVM定量分析模型可有效地监测活体产麻痹性贝毒藻的浓度数值,为产麻痹性贝毒藻浓度检测提供了一种在线检测的新方法。