别藻蓝蛋白β亚基基因在莱茵衣藻中重组表达及其对光能传递的影响研究

为了探究别藻蓝蛋白与类囊体膜光合系统之间的光能传递规律,及其与异源类囊体膜光合系统之间光能转移的可能性,本研究构建了含有钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),及合成藻蓝胆素的血红素氧化酶基因(ho)和铁氧还蛋白氧化还原酶基因(pcyA)的转化载体pHyg3-apcB-ho-pcyA,利用玻璃珠转化法将其导入莱茵衣藻中。聚合酶链式反应筛选验证阳性转化藻株,Southern Blot结果表明基因apcB、ho、pcyA成功转化入莱茵衣藻基因组中。而后将转化藻株与对照藻株均置于高光(50μmol·m^(-2)·s^(-1))和低光(25μmol·m^(-2)·s^(-1))条件、白光和绿光条件中培养,并检测别藻蓝蛋白β亚基的表达、总叶绿素含量、77 K低温荧光、光系统表观电子传递效率、生物量变化。结果显示:实时定量PCR分析和Western Blot检测表明外源基因apcB,pcyA和ho均在转基因藻株Cr-ApcBHP中得到了转录表达。高光和低光条件下光系统Ⅱ(PSⅡ)和光系统Ⅰ(PSⅠ)位置处的荧光峰均显著高于对照莱茵衣藻藻株CC-849,绿光中PSⅡ荧光峰(波长为690 nm)显著高于对照藻株;高光与低光和白光与绿光条件下转基因藻株的光系统Ⅱ的表观电子传递速率(ETRPSⅡ)值均高于对照藻株,但生物量并未见明显提高。这些结果表明转基因莱茵衣藻中可能存在自重组别藻蓝蛋白到光系统核心的光能传递,但是吸收的光能没有达到促进生物量积累的作用。本研究为利用重组表达蓝藻藻胆蛋白提高异源类囊体膜的光合作用进行了尝试。

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白α和β亚基基因序列测定及分析

为了获得江苏吕泗的条斑紫菜藻红蛋白α(Pea)和β(Peb)亚基、藻蓝蛋白α(Pca)和β(Pcb)亚基基因的DNA序列,本文对其基因进行了克隆、序列测定及分析.根据已发表的基因序列(DQ666487.1)设计引物,对提取自条斑紫菜叶状体的DNA进行PCR和电泳鉴定,产物经测序证实获得藻红蛋白序列1 357 bp(HM008263.1)和藻蓝蛋白序列1 335 bp(HM008262.1).上述两段序列与已报道的条斑紫菜相关序列(DQ666487.1)同源性均为99%,与其它几种紫菜相关序列同源性为88%～98%.两段序列均采用多顺反子转录策略,排布顺序为5′Untranslated Regions(UTR)-Peb-间隔区-Pea-3′UTR和5′UTR-Pcb-间隔区-Pca-3′UTR.文中对基因翻译所得氨基酸序列做了理化参数、功能位点及空间构型的预测.基于对序列开放阅读框、启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列的分析,本文对条斑紫菜分类地位进行了讨论.

藻红蓝蛋白α-亚基体外重组体系的优化

对我们建立的藻红蓝蛋白α-亚基体外重组体系进行了优化.实验表明:让表达的不具有组氨酸亲和标记的藻红蓝蛋白α-亚基连接/异构酶E亚基(简称PecE)与具有组氨酸亲和标记的藻红蓝蛋白α-亚基连接/异构酶F亚基(简称Histag-PecF)共同变性再复性,然后通过Ni2+金属鳌合亲和层析提纯PecE/Histag-PecF复合物,该PecE/Histag-PecF具有更好的催化活性.

可逆光致变色的藻红蓝蛋白α亚基分子设计

从层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基基因表达质粒pGEMD pecA出发 ,通过酶切、削平或补齐粘末端及重新环合等技术 ,使其后的阅读框发生移码突变 ,从而得到C 端缺失 2 4个和 36个氨基酸的两个缺失突变体pGEMD pecA C2 4和 pGEMD pecA C36 .用PCR技术将已突变的基因片段转入表达载体 pET30中 ,得到pET30 pecA C2 4和 pET30 pecA C36 ,获得高效表达 .利用PCR技术从 pGEMD pecA中扩增出N 端缺失 2 0个和 32个氨基酸 pecA的突变基因片段 ,并克隆于表达载体 pET30中 ,得到pET30 pecA N2 0和 pET30 pecA N32 ,获得高效表达 .两个C 端缺失突变的脱辅基蛋白无论有或无藻红蓝蛋白连接 /异构酶催化 ,均不能与藻蓝胆素共价偶联 .两个N 端缺失突变脱辅基蛋白均能在藻红蓝蛋白连接 /异构酶催化下与藻蓝胆素共价偶联 。

层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基的固定化与光化学稳定性研究

研究了层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基(α PEC)的可逆光致变色活性的pH稳定性、热稳定性及耐疲劳性等光化学性质。将α PEC固定于琼脂糖、明胶、海藻酸钠和聚乙烯醇-海藻酸钠等不同载体上,检测了固定化α PEC在不同时间、不同可逆光致变色循环次数后的剩余光化学活性,经过对凝胶的机械强度,稳定性及制作工艺等的比较,发现琼脂糖是α PEC的一种较好的固定化载体。

藻红蓝蛋白α-亚基的低温紫外-可见吸收光谱和圆二色光谱的研究

在－１５０～＋２０℃范围测定了藻红蓝蛋白α－亚基的低温紫外－可见吸收光谱和圆二色光谱．通过这些光谱测定表明：在温度低于－９０℃时藻红蓝蛋白α－亚基可逆光化学反应很小，在温度高于－７０℃时藻红蓝蛋白α－亚基能发生可逆光化学反应但不存在中间态．－７０～－９０℃时藻红蓝蛋白α－亚基的可逆光化学反应在紫外－可见吸收光谱和圆二色光谱中产生特定的信号，它们可能相应于藻红蓝蛋白α－亚基可逆光化学反应过程的中间态．这些实验还表明：藻红蓝蛋白α－亚基的脱辅基蛋白没有形成一个特定的空间来允许其辅基色素发生可逆光化学顺反异构化。

坛紫菜藻红、α-藻蓝蛋白和β-亚基基因序列测定及分析

1引言 藻胆蛋白（phycobiliproteins）是海洋藻类特有的捕光色素蛋白,包括藻红蛋白（phycoerythrin）、藻蓝蛋白（phycocyanin）和别藻蓝蛋白（allo-phycocyanin）等,它们存在于红藻、蓝藻、隐藻和少数的甲藻中。目前已知的藻胆蛋白生理功能主要有3种：光合作用捕光色素、藻体细胞贮存蛋白和光形态建成中的光敏素。

藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基半胱氨酸的定点突变及体外重组研究

为研究藻蓝蛋白 (PC)和藻红蓝蛋白 (PEC) β亚基 (分别简称为 β PC、β PEC)生物合成、结构与功能的关系 ,用MegaprimerPCR定点突变技术设计 β PC、β PEC中与藻蓝胆素连接的第二个半胱氨酸的定点突变蛋白质 β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)。将相应的基因片段亚克隆于表达载体pET 30a,并转化大肠杆菌BL2l(DE3)。经IPTG诱导后 ,β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)在大肠杆菌中均得到了高效表达。β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)与藻蓝胆素的重组结果表明两个突变体的结构基本没发生改变 ,有利于对 β PC和 β PEC的生物合成进行进一步研究。

层理鞭枝藻的藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白α-亚基及其色素肽的光化学与光谱性质

用紫外可见吸收和圆二色光谱研究了层理鞭枝藻的藻蓝蛋白α－亚基色素肽和藻红蓝蛋白α－亚基色素肽的可逆光化学，这些研究表明藻蓝蛋白α－亚基色素肽和藻红蓝蛋白α－亚基色素肽分别相应于藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白的辅基色素结构域．藻蓝蛋白α－亚基色素肽的光谱性质和可逆光化学与藻蓝蛋白α－亚基的相应性质很相似，藻红蓝蛋白α－亚基色素肽的光谱性质和可逆光化学与藻红蓝蛋白α－亚基的相应性质相似，不过藻红蓝蛋白α－亚基色素肽还具有一种新的可逆光化学性质，本文中称为类型Ⅲ可逆光化学，藻红蓝蛋白α－亚基在１ｍｏｌ／Ｌ硫氰化钾和４ｍｏｌ／Ｌ尿素中也具有该类型Ⅲ可逆光化学．

海生红藻多管藻R-藻蓝蛋白亚基组成及特性

以海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,经Sephadex G-150凝胶过滤和DEAE-Sepharose FF离子交换层析,从藻胆蛋白提取液中分离纯化出在非变性电泳和非变性等电聚焦中均表现单一条带的R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin,R-PC),等电点为5.6.SDS-PAGE、变性等电聚焦及二维电泳分析表明,所得R-PC含有1种分子质量为18.2kD、pI为6.5的α亚基α16.85.2,含有分子质量为20.0kD和20.9kD、pI为5.5和5.6的4种β亚基β52.05.0、β52.05.9、β52.06.0和β250..69.该结果为深化R-PC的结构功能研究提供了有价值的实验依据.

藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组

利用在大肠杆菌中表达的藻红蓝蛋白 α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素 PCB重组 ,吸收光谱、荧光光谱和高效可逆光化学性质分析表明 ,藻红蓝蛋白 α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素直接重组 ,生成的胆素蛋白中辅基色素仍为藻蓝胆素 ;而藻红蓝蛋白 α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素在藻红蓝蛋白 α-亚基重组酶 (pec E和 pec F基因的表达产物 )催化下重组 ,生成的胆素蛋白中辅基色素转变为藻紫胆素 ,并具有高效可逆光化学特性。

鱼腥藻PCC7120藻红蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻红蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的4种重组质粒pETDuetp-ecA、pCOLADuet-pecE、pCDFDuetp-ecF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因pecE和pecF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻红蓝蛋白α亚基基因pecA共同转入大肠杆菌BL21(DE3),通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的PecA-PCB。结果表明生成的色素藻胆蛋白具有藻红蓝蛋白α-亚基所特有的光谱性质和可逆光致变色性质。而在裂合酶基因pecE和pecF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.1%的PecA-PCB产生。以上研究对藻胆蛋白生物构建具有重要意义。

层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基的分离纯化和结晶

藻红蓝蛋白α -亚基具有高效可逆光致变色性质。采用DEAE -纤维素柱层析、SephadexG -75凝胶过滤、FPLC -Superdex75HR10/30柱层析等纯化方法 ,得到了电泳纯的藻红蓝蛋白α-亚基 ,光化学活性达93%。在室温、避光条件下 ,采用悬滴汽相扩散法 ,得到了两种外形不同的藻红蓝蛋白α -亚基晶体 ,进一步证实了上述纯化方法的可靠性。

层理鞭枝藻藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基Cys-155的藻胆色素共价偶联

层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus PCC7603)藻蓝蛋白β-CPC和藻红蓝蛋白β-PEC中均存在2个藻胆色素结合位点(Cys-84和Cys-155),可与藻蓝胆素(简称PCB)发生共价偶联反应,已有研究证实编码基因为alr0617的裂合酶CpcS1是催化Cys-84与PCB共价偶联的裂合酶。在研究Cys-155与PCB共价偶联的过程中,通过BLAST软件同源性对比分析后,筛选出4个基因:cpcT1、cpcT2、cpcS1、cpcS,其中基因cpcT1和cpcS2,利用分子克隆的技术,根据实验需要转到载体pCDFDuet上,通过DNA电泳和蛋白质电泳挑选出正确的克隆。此4个基因对应的质粒与在大肠杆菌内生成PCB必需的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA,以及质粒pET-cpcB(C84S)或pET-pecB(C84A),共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,得到各重组蛋白,经过亲和层析柱提纯并透析,过滤掉金属离子,纯化透析后的蛋白经过活性比较、蛋白质电泳以及锌染色、蛋白质变性等试验以及荧光和紫外吸收光谱等鉴定,通过与相应文献中PCB光谱的比对,确定编码基因为all5339的裂合酶CpcT1能高效地催化Cys-155与PCB共价偶联,而其余3个基因不能起到催化作用。由此,能催化脱辅基蛋白β-CPC和β-PEC的两个位点共价偶联PCB的裂合酶均被发现。实验对于研究藻胆蛋白的生物合成、光合作用捕光机理以及藻胆体的组装等有重要的意义。

重组藻红蓝蛋白α亚基的稳定性研究

采用基因重组的方法从大肠杆菌体内获得藻红蓝蛋白a亚基,该蛋白是具有天然活性的红色荧光蛋白。从温度、pH、光照、离子浓度等方面考察该色素蛋白的稳定性影响,同时考察了一些金属离子和小分子对其荧光紫外光谱影响。研究表明,温度低于37℃能较好的保存蛋白;pH在4～9之间蛋白较稳定存在;紫外照射能破坏蛋白结构、避光可以保持蛋白稳定;离子强度对蛋白没有多大影响;碳水化合物影响较小;而多数金属离子对蛋白荧光有猝灭作用等。这些研究都为藻红蓝蛋白作为食品化妆品天然色素的应用研究打下基础。

藻红蓝蛋白β亚基体内重组及其色谱分析

藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白,其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接。大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成,但是这方面的报道不是很多。藻红蓝蛋白由两个亚基组成,β亚基(简称β-PEC)含171个氨基酸残基及两个辅基色素藻蓝胆素(简称PCB),分别在Cys-84和Cys-155位以硫醚键共价相连。通过同源性分析获得的由编号为alr0617基因编码的蛋白为藻红蓝蛋白β亚基(β-PEC)中的Cys-84与PCB的连接的催化酶。为了研究层理鞭枝藻藻红蓝蛋白(PEC)β亚基(β-PEC)中藻蓝胆素(PCB)与脱辅基蛋白的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-PecB(C155I),分析表明该色素蛋白与β-PEC的吸收光谱和荧光光谱一致。酸性尿素变性实验证明得到的色素蛋白中的藻蓝胆素PCB没有被破坏。使用胃蛋白酶对天然藻红蓝色素蛋白和重组藻红蓝色素蛋白进行相同条件的水解并得到各自的色素肽,高效液相色谱分析表明这两种色素肽相同,由此证明了编号为alr0617基因编码的蛋白质能催化PCB与PecB(C155I)正确共价偶联。

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用 Ｐ Ｃ Ｒ技术从层理鞭枝藻总 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增藻红蓝蛋白 α亚基脱辅基蛋白的基因（ｐｅｃ Ａ）， 将ｐｅｃ Ａ 克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，然后将ｐｅｃ Ａ 基因插入表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｄ，形成的重组质粒在 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）中获得了高效表达，表达蛋白形成包涵体．高效表达的蛋白质的分子量为１９×１０３ ，与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致，经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ

用液相等电聚焦电泳纯化藻蓝蛋白亚基

以纯藻蓝蛋白(C-phycocyan in,C-PC)为材料,采用Rotofor系统进行液相等电聚焦(L iqu id-phase iso-eletric focusing,LP-IEF)电泳纯化C-PC的α,β亚基,探讨蛋白质亚基纯化的制备电泳(Preparative eletro-phoresis)技术.结果显示,样品经2次等电聚焦电泳后,C-PC的α,β亚基分别浓集在pH=4.9和pH=4.1附近,平板超薄等电聚焦(Slab u ltra th in IEF)和SDS-PAGE电泳鉴定表明分别为高纯度的C-PCα,β亚基.提示LP-IEF是分离纯化等电点差异蛋白质活性亚基的简便有效的方法.

条斑紫菜中R-藻红蛋白的纯化及其α和β亚基的分离与发色团含量的测定

本文从条斑紫菜(Porphyra yezoensis)中提取了藻胆蛋白,找到了一种新的简便有效的提纯R-藻红蛋白的方法。用Bio-GelP300柱进一步纯化后,得到了高纯度的R-藻红蛋白。用Bio-Rex 70柱分离R-藻红蛋白,得到了它的α和β亚基溶液。对亚基溶液进行的一些光谱分析表明亚基溶液具有R-藻红蛋白的一些性质。本文对α和β亚基的发色团含量进行了测定:α亚基含2个藻红胆素,β亚基含3个藻红胆素和1个藻尿胆素。

多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白的制备及其相对分子质量的测定

以海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,通过凝胶过滤层析、离子交换柱层析、凝胶电泳,得到纯度较高的R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白.在SDS-PAGE中,藻红蛋白表现出4个带有发色团的亚基α、β、β'、γ和γ',其相对分子质量分别为1.73×1041,.95×104,3.33×104和3.10×104;藻蓝蛋白则表现出3个带有发色团的亚基,分别是:α、β和β',其相对分子质量为1.75×1042,.13×104和2.62×104.不同相对分子质量的γ亚基和β亚基的发现都有别于先前的报道,这对藻红蛋白和藻蓝蛋白结构的研究提供了有价值的研究结果.选用Superdex-200凝胶柱层析对纯化的藻红蛋白和藻蓝蛋白进行了相对分子质量测定,藻红蛋白相对分子质量为2.4×105,藻蓝蛋白相对分子质量为1.36×105这表明纯化制备的藻红蛋白和藻蓝蛋白分别以六聚体((αβ)3γ(αβ)3)和三聚体((αβ)3)形式存在.