眉藻PCC7601藻红蛋白α亚基基因克隆、表达及生物信息学分析

以眉藻PCC7601总DNA为模板,采用PCR方法扩增得到cpeA基因全长片段,连接到克隆载体pBluescriptSK(+),然后转移到表达载体pET30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,同时运用相关软件分析基因编码蛋白的生物信息学特征。结果表明:克隆得到的cpeA基因片段与GenBank数据库中的序列一致,表达出的重组蛋白cpeA以包含体形式存在。该基因编码的蛋白是亲水的,分子量为17.63 ku,等电点为6.58;包含75.61%的α-螺旋、4.27%的β-转角、2.44%的延伸链和17.68%的不规则卷曲,定位在细胞类囊体膜上。

可逆光致变色的藻红蓝蛋白α亚基分子设计

从层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基基因表达质粒pGEMD pecA出发 ,通过酶切、削平或补齐粘末端及重新环合等技术 ,使其后的阅读框发生移码突变 ,从而得到C 端缺失 2 4个和 36个氨基酸的两个缺失突变体pGEMD pecA C2 4和 pGEMD pecA C36 .用PCR技术将已突变的基因片段转入表达载体 pET30中 ,得到pET30 pecA C2 4和 pET30 pecA C36 ,获得高效表达 .利用PCR技术从 pGEMD pecA中扩增出N 端缺失 2 0个和 32个氨基酸 pecA的突变基因片段 ,并克隆于表达载体 pET30中 ,得到pET30 pecA N2 0和 pET30 pecA N32 ,获得高效表达 .两个C 端缺失突变的脱辅基蛋白无论有或无藻红蓝蛋白连接 /异构酶催化 ,均不能与藻蓝胆素共价偶联 .两个N 端缺失突变脱辅基蛋白均能在藻红蓝蛋白连接 /异构酶催化下与藻蓝胆素共价偶联 。

重组藻红蓝蛋白α亚基的稳定性研究

采用基因重组的方法从大肠杆菌体内获得藻红蓝蛋白a亚基,该蛋白是具有天然活性的红色荧光蛋白。从温度、pH、光照、离子浓度等方面考察该色素蛋白的稳定性影响,同时考察了一些金属离子和小分子对其荧光紫外光谱影响。研究表明,温度低于37℃能较好的保存蛋白;pH在4～9之间蛋白较稳定存在;紫外照射能破坏蛋白结构、避光可以保持蛋白稳定;离子强度对蛋白没有多大影响;碳水化合物影响较小;而多数金属离子对蛋白荧光有猝灭作用等。这些研究都为藻红蓝蛋白作为食品化妆品天然色素的应用研究打下基础。

带跨膜片段的α-PEC的分子构建

通过分子设计构建一段来自人红细胞膜上的血型糖蛋白A(glycophorin A,GPA)中的跨膜片段基因,并连接到藻红蓝蛋白基因片段(pecA)的N端,将融合基因插入到表达载体pET30a进行表达。表达产物以包涵体形式存在,通过优化条件使其溶解,并与藻蓝胆素PCB在裂合异构酶PecE/PecF催化下进行体外重组,通过可逆光致变色活性大小确定包涵体溶解的最佳条件。结果表明,超声后的细胞加入终浓度8 mol/L尿素,0.2%Triton X-100和一定量的PecE和PecF,透析时采用含0.2%Triton X-100的尿素梯度透析可使重组活性最高。研究为可逆光致变色生物材料在生物光电材料中的应用打下了基础。