藻红蛋白亚基光敏剂对小鼠移植瘤作用的超微结构研究

目的:从形态学角度探讨藻红蛋白(R-PE)β亚基光动力学抗肿瘤效果及其作用机理。方法:用不同密度的波长为496nm的氩离子激光对S180小鼠移植瘤进行β亚基光动力学治疗,并对治疗后的瘤体进行透射电镜的形态学观察。结果:用100μg/ml的β亚基,在200J/cm2激光照射剂量条件下治愈了瘤体直径为0.5cm-0.7cm大小的小鼠移植瘤,发现瘤组织中引起细胞死亡的途经有差异,被PDT抑制的肿瘤内部细胞表现出典型的凋亡细胞特征。结论:R-PEβ亚基具较强的光动力学抗肿瘤效果,光动力治疗机理可能涉及肿瘤内部细胞死亡主要是凋亡途径而瘤周为坏死,且与血管系统破坏及白细胞参与的抗炎症反应相关。

可逆光致变色的藻红蓝蛋白α亚基分子设计

从层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基基因表达质粒pGEMD pecA出发 ,通过酶切、削平或补齐粘末端及重新环合等技术 ,使其后的阅读框发生移码突变 ,从而得到C 端缺失 2 4个和 36个氨基酸的两个缺失突变体pGEMD pecA C2 4和 pGEMD pecA C36 .用PCR技术将已突变的基因片段转入表达载体 pET30中 ,得到pET30 pecA C2 4和 pET30 pecA C36 ,获得高效表达 .利用PCR技术从 pGEMD pecA中扩增出N 端缺失 2 0个和 32个氨基酸 pecA的突变基因片段 ,并克隆于表达载体 pET30中 ,得到pET30 pecA N2 0和 pET30 pecA N32 ,获得高效表达 .两个C 端缺失突变的脱辅基蛋白无论有或无藻红蓝蛋白连接 /异构酶催化 ,均不能与藻蓝胆素共价偶联 .两个N 端缺失突变脱辅基蛋白均能在藻红蓝蛋白连接 /异构酶催化下与藻蓝胆素共价偶联 。

眉藻PCC7601藻红蛋白α亚基基因克隆、表达及生物信息学分析

以眉藻PCC7601总DNA为模板,采用PCR方法扩增得到cpeA基因全长片段,连接到克隆载体pBluescriptSK(+),然后转移到表达载体pET30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,同时运用相关软件分析基因编码蛋白的生物信息学特征。结果表明:克隆得到的cpeA基因片段与GenBank数据库中的序列一致,表达出的重组蛋白cpeA以包含体形式存在。该基因编码的蛋白是亲水的,分子量为17.63 ku,等电点为6.58;包含75.61%的α-螺旋、4.27%的β-转角、2.44%的延伸链和17.68%的不规则卷曲,定位在细胞类囊体膜上。

藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基半胱氨酸的定点突变及体外重组研究

为研究藻蓝蛋白 (PC)和藻红蓝蛋白 (PEC) β亚基 (分别简称为 β PC、β PEC)生物合成、结构与功能的关系 ,用MegaprimerPCR定点突变技术设计 β PC、β PEC中与藻蓝胆素连接的第二个半胱氨酸的定点突变蛋白质 β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)。将相应的基因片段亚克隆于表达载体pET 30a,并转化大肠杆菌BL2l(DE3)。经IPTG诱导后 ,β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)在大肠杆菌中均得到了高效表达。β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)与藻蓝胆素的重组结果表明两个突变体的结构基本没发生改变 ,有利于对 β PC和 β PEC的生物合成进行进一步研究。

藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组

利用在大肠杆菌中表达的藻红蓝蛋白 α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素 PCB重组 ,吸收光谱、荧光光谱和高效可逆光化学性质分析表明 ,藻红蓝蛋白 α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素直接重组 ,生成的胆素蛋白中辅基色素仍为藻蓝胆素 ;而藻红蓝蛋白 α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素在藻红蓝蛋白 α-亚基重组酶 (pec E和 pec F基因的表达产物 )催化下重组 ,生成的胆素蛋白中辅基色素转变为藻紫胆素 ,并具有高效可逆光化学特性。

层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基的分离纯化和结晶

藻红蓝蛋白α -亚基具有高效可逆光致变色性质。采用DEAE -纤维素柱层析、SephadexG -75凝胶过滤、FPLC -Superdex75HR10/30柱层析等纯化方法 ,得到了电泳纯的藻红蓝蛋白α-亚基 ,光化学活性达93%。在室温、避光条件下 ,采用悬滴汽相扩散法 ,得到了两种外形不同的藻红蓝蛋白α -亚基晶体 ,进一步证实了上述纯化方法的可靠性。

重组藻红蓝蛋白α亚基的稳定性研究

采用基因重组的方法从大肠杆菌体内获得藻红蓝蛋白a亚基,该蛋白是具有天然活性的红色荧光蛋白。从温度、pH、光照、离子浓度等方面考察该色素蛋白的稳定性影响,同时考察了一些金属离子和小分子对其荧光紫外光谱影响。研究表明,温度低于37℃能较好的保存蛋白;pH在4～9之间蛋白较稳定存在;紫外照射能破坏蛋白结构、避光可以保持蛋白稳定;离子强度对蛋白没有多大影响;碳水化合物影响较小;而多数金属离子对蛋白荧光有猝灭作用等。这些研究都为藻红蓝蛋白作为食品化妆品天然色素的应用研究打下基础。

藻红蓝蛋白β亚基体内重组及其色谱分析

藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白,其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接。大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成,但是这方面的报道不是很多。藻红蓝蛋白由两个亚基组成,β亚基(简称β-PEC)含171个氨基酸残基及两个辅基色素藻蓝胆素(简称PCB),分别在Cys-84和Cys-155位以硫醚键共价相连。通过同源性分析获得的由编号为alr0617基因编码的蛋白为藻红蓝蛋白β亚基(β-PEC)中的Cys-84与PCB的连接的催化酶。为了研究层理鞭枝藻藻红蓝蛋白(PEC)β亚基(β-PEC)中藻蓝胆素(PCB)与脱辅基蛋白的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-PecB(C155I),分析表明该色素蛋白与β-PEC的吸收光谱和荧光光谱一致。酸性尿素变性实验证明得到的色素蛋白中的藻蓝胆素PCB没有被破坏。使用胃蛋白酶对天然藻红蓝色素蛋白和重组藻红蓝色素蛋白进行相同条件的水解并得到各自的色素肽,高效液相色谱分析表明这两种色素肽相同,由此证明了编号为alr0617基因编码的蛋白质能催化PCB与PecB(C155I)正确共价偶联。

鱼腥藻PCC7120基因all5292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶(biliprotein lyase)编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中获取了同源基因all5292和alr0647。同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53.4%和61.4%。随后,对这两个基因进行了初步研究。结果显示:All5292和Alr0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白(phycocyanin)或藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)β亚基上的功能。通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索。结果表明:all5292和alr0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达。

带跨膜片段的α-PEC的分子构建

通过分子设计构建一段来自人红细胞膜上的血型糖蛋白A(glycophorin A,GPA)中的跨膜片段基因,并连接到藻红蓝蛋白基因片段(pecA)的N端,将融合基因插入到表达载体pET30a进行表达。表达产物以包涵体形式存在,通过优化条件使其溶解,并与藻蓝胆素PCB在裂合异构酶PecE/PecF催化下进行体外重组,通过可逆光致变色活性大小确定包涵体溶解的最佳条件。结果表明,超声后的细胞加入终浓度8 mol/L尿素,0.2%Triton X-100和一定量的PecE和PecF,透析时采用含0.2%Triton X-100的尿素梯度透析可使重组活性最高。研究为可逆光致变色生物材料在生物光电材料中的应用打下了基础。