3种蓝细菌藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因的克隆、表达及重组蛋白的抗氧化活性

为研究蓝细菌藻蓝蛋白脱辅基蛋白的抗氧化活性,分别从3种蓝细菌Spirulina subsalsa、Mastigocladus laminosus和Nostoc PCC 7120中克隆C-藻蓝蛋白β亚基编码基因cpcB_(Sp)、cpcB_(Ma)和cpcB_(No),在大肠杆菌中表达,获得了重组蛋白CpcB_(Sp)、CpcB_(Ma)和CpcB_(No)。通过测定其对羟基自由基和DPPH自由基的清除率,比较它们的抗氧化活性。结果显示:3种重组蛋白对羟基自由基和DPPH自由基的清除率都随着蛋白质质量浓度的增加而升高。当蛋白质浓度达到250 mg/L时,CpcB_(Sp)、CpcB_(Ma)和CpcB_(No)对羟基自由基的清除率分别为82%、89%和93%,对DPPH自由基的清除率分别为43%、49%和58%。以上结果表明,3种重组藻蓝蛋白脱辅基蛋白都具有较高的抗氧化活性,有潜力作为医疗上使用的抗氧化试剂,不同蓝细菌的同源藻蓝蛋白的抗氧化能力存在一定差异,选择不同蓝细菌的藻蓝蛋白是提高重组藻蓝蛋白抗氧化能力的有效途径。

层理鞭枝藻藻蓝蛋白β亚基的体内重组

为研究藻蓝蛋白β亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pET-cpcB(C155I)、pCDFDu-et-cpeS和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpeS、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和藻蓝蛋白β脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)共同转入大肠杆菌.通过色素蛋白锌电泳和光谱检测,结果表明产生了有生物活性的CpcB(C155I)-PCB.而在裂合酶基因cpeS不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有7.6%的CpcB(C155I)-PCB产生.实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白β亚基84位半胱氨酸残基与PCB连接,为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础.

不同纯度藻蓝蛋白对ABTS阳离子自由基清除动力学研究

为探究不同纯度藻蓝蛋白抗氧化动力学特点,利用2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2′-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)阳离子自由基法,测定并建立5种不同纯度藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的剂量、时间变化关系,并建立准一级、准二级反应动力学模型,拟合得出反应速率常数,同时分析建立反应速率常数与藻蓝蛋白纯度、色基含量及蛋白质含量的关系.结果发现,5种藻蓝蛋白均能较好地清除ABTS阳离子自由基,其清除率与藻蓝蛋白呈线性量效关系,准二级反应动力学能更好地拟合藻蓝蛋白对ABTS阳离子自由基清除率,且藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基反应的动力学速率常数与藻蓝蛋白的蛋白质含量纯度成正相关,与藻蓝蛋白的色基相关性不显著或呈负相关,表明藻蓝蛋白对ABTS阳离子自由基起主要清除作用的是藻蓝蛋白中蛋白质部分.

几种重组别藻蓝蛋白的抗氧化活性

藻胆蛋白是某些藻类特有的捕光色素蛋白,其中天然别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白的抗氧化活性已经被证明。实验以2,2-盐酸脒基丙烷(AAPH)为自由基生成者,应用藏红花素退色反应为检测清除氢过氧自由基的方法,探讨了在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并纯化的带有6×His(6×组氨酸)标签和带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的重组别藻蓝蛋白及其α、β亚基的抗氧化活性。结果表明,带有His标签的6×Hisα-APC、6×Hisβ-APC和6×His-APC均显示出一定的清除氢过氧自由基的能力,其中6×Hisβ-APC清除氢过氧自由基的IC50值可达到27.2 mg/L,Ka/Kc(氢过氧自由基与重组别藻蓝蛋白和藏红花素反应的速度常数比)达到1.24,大于带有色素基团的天然APC清除氢过氧自由基能力(IC5057.5 mg/L);而带有MBP标签的重组别藻蓝蛋白亚基MBPα-APC和MBPβ-APC和MBP-APC(rAPC)则无明显的清除能力。结果首次证实了脱辅基蛋白具有清除氢过氧自由基能力,因而在天然藻胆蛋白中脱辅基蛋白是清除自由基的贡献者之一,这为进一步研究重组别藻蓝蛋白的抗肿瘤机理提供了线索。

藻蓝蛋白对大鼠脑缺血再灌注后MMP-2和MMP-9表达的影响

目的探讨藻蓝蛋白对大鼠局灶性脑缺血再灌注后基质金属蛋白酶-2和9（MMP-2和MMP-9）表达的影响。方法应用线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉阻塞再灌注（MCAO／R）模型，应用藻蓝蛋白进行干预，干湿重法测定脑组织含水量（BWC），比色法测定脑组织伊文斯蓝（EB）含量，免疫组化技术检测脑组织MMP-2和MMP-9的表达。结果脑缺血再灌注6h BWC和EB含量增加，至2d达高峰，应用藻蓝蛋白后均明显减少。对照组脑缺血再灌注24h脑组织MMP-2阳性细胞即开始出现，3～7d阳性细胞数达高峰，14d仍高于假手术组。藻蓝蛋白组MMP-2阳性细胞的变化趋势与对照组相似，但同一时间点明显低于对照组。对照组缺血侧脑组织MMP-9阳性细胞于再灌注后6h开始出现，12h明显增高，至2d达高峰，3d开始减少，至14d时恢复至假手术组水平。藻蓝蛋白组MMP-9阳性细胞变化趋势与对照组相似，同一时间点相比明显低于对照组。结论藻蓝蛋白可能通过下调MMP-2和MMP-9的表达而减轻脑水肿，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

硒化藻蓝蛋白生物材料抗肝癌作用的研究

从富硒培养的钝顶螺旋藻中提取、纯化硒化藻蓝蛋白,采用光固定法固定硒化藻蓝蛋白到组织培养聚苯乙烯(PS1)基板上,制备生物材料.研究这种材料对体外肝癌细胞7402的抑制作用,并与藻蓝蛋白固定化材料以及亚硒酸钠作对照.

海水螺旋藻C-藻蓝蛋白富硒及其抗氧化特性

对海水钝顶螺旋藻Spirulina platensisC-藻蓝蛋白的富硒能力及含硒C-藻蓝蛋白对超氧阴离子(O2-.)和羟基自由基(.OH)的清除作用进行了研究。结果表明,在添加低浓度硒(40—80mg.L-1)培养时,海水钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白对硒的富集效果显著强于淡水螺旋藻C-藻蓝蛋白。硒浓度为40mg.L-1时,C-藻蓝蛋白对硒的利用率最高,富硒系数最大(0.9%);硒浓度为60mg.L-1时,C-藻蓝蛋白含硒量最高(402mg.kg-1)。含硒C-藻蓝蛋白比C-藻蓝蛋白对超氧阴离子和羟基自由基的清除作用都有所加强,清除效应与C-藻蓝蛋白的含硒量及蛋白浓度呈正相关。C-藻蓝蛋白含硒量最高组(402mg.kg-1)在浓度为180μg.ml-1时,对超氧阴离子和羟基自由基的清除率分别可达到83%和35%,远高于同样条件下其他淡水种类相应蛋白的清除作用。研究结果显示,利用海水培养的螺旋藻能显著提高C-藻蓝蛋白的富硒能力和含硒C-藻蓝蛋白清除超氧阴离子的活性。此研究对开发具有抗氧化功能的含硒C-藻蓝蛋白显示出独特的技术优势和较大的应用潜力。

5种不同纯度藻蓝蛋白的抗氧化特性

为深入探讨藻蓝蛋白中起抗氧化作用的基团,本实验采用铁离子总还原能力法、2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)阳离子自由基法、邻苯三酚自氧化法、氧自由基吸收能力法测定5种不同藻蓝蛋白的抗氧化活性并分析其抗氧化活性与蛋白质量浓度、色基含量和藻蓝蛋白纯度的关系。结果表明,在铁离子总还原能力、ABTS阳离子自由基等以电子转移为主的抗氧化体系中,藻蓝蛋白的抗氧化活性与蛋白质量浓度呈正相关,说明在上述两种体系中,藻蓝蛋白中起抗氧化作用的主要基团是蛋白质;在邻苯三酚自氧化的活性氧体系中,藻蓝蛋白的抗氧化活性与蛋白质量浓度呈正相关,与色基含量呈负相关,表明在该体系中,藻蓝蛋白中发挥抗氧化作用的基团是蛋白质;在氧自由基吸收能力基于氢原子转移的抗氧化体系中,藻蓝蛋白的抗氧化活性与色基及纯度呈正相关,说明在该体系中,色基是藻蓝蛋白发挥抗氧化作用的主要基团。

不同纯度藻蓝蛋白对A549和HCCLM3的抗癌活性比较

目的 比较5种不同纯度藻蓝蛋白的抗癌活性差异,并分析其抗癌活性与蛋白质含量、色基含量和藻蓝蛋白纯度的关系。方法 测定了5种不同藻蓝蛋白对两种癌细胞:人胞肺癌细胞(humanpulmonary carcinoma cell,A549)和人高转移肝癌细胞(human highly metastatic liver cancer cell,HCCLM3)的抑制率、细胞体外迁移能力、细胞凋亡率。结果 5种藻蓝蛋白均可抑制两种癌细胞的增殖、迁移,诱导癌细胞凋亡。除藻蓝蛋白B外,其他4种藻蓝蛋白对癌细胞的抑制率具有明显的剂量效应和时间效应关系,藻蓝蛋白C抑制癌细胞迁移效果显著(P<0.05)优于其他4种藻蓝蛋白,25mg/mL的藻蓝蛋白A、B、C、E、F对A549作用48h的抑制率分别为84.29%±0.74%、41.81%±4.79%、79.61%±0.76%、58.66%±3.85%、71.39%±3.84%,对HCCLM3的抑制率分别为93.21%±3.40%、37.64%±2.63%、91.02%±4.55%、57.71%±7.64%、83.01%±3.98%;偏相关和热图分析发现藻蓝蛋白的抑癌活性与其色基及纯度成负相关,与蛋白质含量呈正相关。结论 5种藻蓝蛋白抗癌活性存在一定差异,其中藻蓝蛋白C抗癌活性更好。蛋白质部分可能是藻蓝蛋白的主要抑癌基团。

蓝藻资源化技术研究及应用进展

针对蓝藻资源化问题,概述国内外利用蓝藻制备有机肥、提取高纯度藻蓝蛋白、制备活性炭和藻粉这4种利用方式的特点、现状及应用进展。提出,应从高温好氧堆肥技术、藻蓝蛋白提取技术和藻水分离技术这3个方面,解决其关键技术问题并进行进一步研究开发。

重组别藻蓝蛋白(holo-apcB)的抗氧化活性研究

本研究利用代谢工程技术原理在重组大肠杆菌表达合成了嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)别藻蓝蛋白β亚基(holo-apcB),并利用亲和层析的方法对holo-apcB进行了分离纯化。SDS-PAGE电泳胶图显示,holo-apcB分子量与18.4 ku的蛋白条带相近,与理论分子量吻合。光谱学分析结果显示,其最大吸收峰为615 nm,最大荧光发射峰为640 nm,与天然别藻蓝蛋白β亚基具有相同的分子量和光谱学性质。在55℃条件下,holo-apcB的半衰期高达31.9 h。以嗜热聚球藻天然别藻蓝蛋白(APC)及脱辅基别藻蓝蛋白β亚基(apo-apcB)为参照,分析了holo-apcB的抗氧化活性。结果显示,holo-apcB具有最强的抗氧化能力,其清除羟自由基和氢过氧自由基半数抑制浓度(IC50)分别为224.9μg/mL和20.6μg/mL,显著低于apo-apcB和天然APC的IC50,这表明holo-apcB中的藻蓝胆素也参与了抗氧化过程。