虎纹捕鸟蛛毒素-ILys13突变对生物学活性的影响

从虎纹捕鸟蛛Selenocosmia(Ornithoctonus)huwena的粗毒中分离纯化出来的虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)是一种多肽类神经毒素。为了进一步探明其结构与功能的关系,采用以固相多肽合成为核心技术的蛋白质工程方法直接构建了Ala取代Lys13的单残基突变体K13A-HWTX-Ⅰ,并同时合成了HWTX-Ⅰ的全序列sHWTX-Ⅰ作实验对照。合成产物经质谱和序列分析鉴定无误后在含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠并用离子交换和RP-HPLC纯化。活性测定结果表明,氧化复性后,sHWTX-Ⅰ与天然HWTX-Ⅰ的生物学活性完全相同,而K13A-HWTX-I的生物学活性下降了87％,提示Lys13是与HWTX-Ⅰ的生物学活性密切相关的重要残基。

ω-芋螺毒素MVIIA/虎纹捕鸟蛛毒素-I嵌合体HM-1227的合成及活性测定

用Fmoc固相多肽合成的方法手工合成了一种ω 芋螺毒素MVIIA和虎纹捕鸟蛛毒素 I的嵌合体HM 1 2 2 7,经过RP HPLC纯化和氧化复性 ,小鼠隔神经 隔肌标本的阻断实验显示此嵌合体能实现二硫键完全配对与稳定折叠并具有微弱的神经毒活性 .实验结果表明 ,ω CtxMVIIA和HWTX I的分子框架稳定 ,部分序列交换后仍能实现二硫键配对与折叠 。

重组虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ在巴氏毕赤酵母中的表达及纯化

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化 ,具有镇痛活性的肽类神经毒素。对巴氏毕赤酵母生产的重组HWTX Ⅰ进行多步纯化 ,首先将分泌到培养上清的rHWTX Ⅰ进行 90 %饱和度的 (NH4) 2 SO4沉淀 ,再用截留分子量 3kD的滤膜脱盐 ,再用CM阳离子交换层析分离 ,最后用C1 8反相层析脱盐纯化 ,真空干燥后得到的rHWTX Ⅰ经TricineSDS PAGE ,质谱鉴定 ,氨基酸组成分析 ,N 端序列测定及活性鉴定 ,证明已获得高纯度的重组HWTX Ⅰ ,摇瓶表达量约为 80mg L ,约占总分泌量的 2 3.6 % ,并对摇瓶发酵条件进行了优化 ,为利用基因工程方法生产HWTX

虎纹捕鸟蛛毒素HWTX-Ⅰ和芋螺毒素MVIIA嵌合体的固相化学合成

采用Fmoc固相合成的方法 ,将来自芋螺的ω 芋螺毒素 (ω Conotoxin)MVIIA (N 型钙离子通道阻断剂 )中已知活性位点及可能的相关序列嵌入虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )的非活性位点区 ,代替其相应序列 ,构建同时携带两种活性位点的多肽嵌合体 .嵌合体用MALDI TOF质谱鉴定 .通过RP HPLC检测其氧化复性过程 ,摸索出嵌合体的最佳复性条件 .经过两次RP HPLC脱盐纯化 .结果表明 ,设计合成的嵌合体在 1× 10 5g/mL ,利用小鼠隔神经 隔肌标本的阻断实验证明嵌合体显示了 2 7%的天然HWTX Ⅰ的神经毒活性 .实验结果表明 ,HWTX