虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa的基因克隆及在酿酒酵母中的表达

目的基因克隆和表达虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa,并进行纯化和质谱鉴定。方法通过随机测序虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)毒腺cDNA文库,获得编码多肽毒素HWTX-XVⅡa的基因,对其进行生物信息学分析;构建HWTX-XVⅡa基因真核表达质粒,利用S78株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统进行分泌表达,表达产物经离子交换、反相高效液相色谱分离纯化和质谱鉴定。结果克隆得到虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa的基因,构建的真核表达质粒表达产物纯化后进行质谱鉴定,为分子质量单位为3.250 004ku的虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa。结论获得虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa的基因及其表达产物,为研究其生物学功能奠定了基础。

化学合成虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅱ基因的克隆

报道了全化学合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅱ (HWTX Ⅱ )基因 ,在克隆载体pBluescript中的克隆 .但HWTX Ⅱ基因在表达载体pGEX KT中几乎无表达 .根据以前成功地表达全化学合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因的实验结果 ,对在同一表达系统所构建的HWTX Ⅰ与HWTX Ⅱ基因的表达产物进行比较 ,认为HWTX Ⅰ与HWTX Ⅱ在原核表达系统的表达行为上的差异有助于我们进一步探讨HWTX

重组虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ在巴氏毕赤酵母中的表达及纯化

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化 ,具有镇痛活性的肽类神经毒素。对巴氏毕赤酵母生产的重组HWTX Ⅰ进行多步纯化 ,首先将分泌到培养上清的rHWTX Ⅰ进行 90 %饱和度的 (NH4) 2 SO4沉淀 ,再用截留分子量 3kD的滤膜脱盐 ,再用CM阳离子交换层析分离 ,最后用C1 8反相层析脱盐纯化 ,真空干燥后得到的rHWTX Ⅰ经TricineSDS PAGE ,质谱鉴定 ,氨基酸组成分析 ,N 端序列测定及活性鉴定 ,证明已获得高纯度的重组HWTX Ⅰ ,摇瓶表达量约为 80mg L ,约占总分泌量的 2 3.6 % ,并对摇瓶发酵条件进行了优化 ,为利用基因工程方法生产HWTX

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ-(HWTX-Ⅰ)28肽类似物的化学合成与活性鉴定

虎纹捕鸟蛛毒素-(huwentoxin-,HWTX-)是从我国虎纹捕鸟蛛毒素中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素.该多肽分子由33个氨基酸残基组成,含三对二硫键.其一级结构和三级结构均已测定.弄清该毒素的活性部位,是研究其结构功能关系的基础.用固相Fmoc化学合成的方法,合成了虎纹捕鸟蛛-的28肽类似物.该突变体去掉了天然毒素分子N端的Alal和C端的Lys30-Trp31-Lys32-Leu33共5个残基.用氧化还原型谷胱甘肽法完成二硫键配对,并用HPLC进行纯化,所得突变体与天然HWTX-的紫外光谱相似.质谱鉴定确认合成产物正确,分子量为3124,浓度为1×10-5g/ml的突变体能可逆阻断小白鼠膈神经-膈肌的接头传递,阻断时间为60～70min.与天然毒素比较,活性有所下降.结果说明HWTX-的N端、C端残基对其生物活性有一定影响,但不是位于活性中心的重要残基.由结果推测。

虎纹捕鸟蛛毒素-I(HWTX-I)对豚鼠回肠的作用机制研究

虎纹捕鸟蛛毒素ＨＷＴＸ－Ｉ（５ｍｇ／Ｌ）对电刺激豚鼠回肠引起的一过性收缩有非常明显的抑制作用．ＨＷＴＸ－Ｉ的抑制作用发生后，乙酰胆碱（ＡＣｈ）诱发的回肠收缩幅度与使用ＨＷＴＸ－Ｉ前无明显差异．在使用酚妥拉明后，ＨＷＴＸ－Ｉ仍能抑制豚鼠回肠的一过性收缩．

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体K3A-HWTX-Ⅰ的化学合成与生理活性分析

采用固相Ｆｍｏｃ法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了其第３位赖氨酸（Ｋ３）被丙氨酸（Ａ）取代的虎纹捕鸟蛛毒素－Ⅰ的突变体Ｋ３Ａ－ＨＷＴＸ－Ⅰ．合成的突变体用Ｅｄｍａｎ降解和电喷雾质谱进行鉴定．Ｋ３Ａ－ＨＷＴＸ－Ⅰ经谷胱甘肽系统进行氧化复性后通过离子交换和反相ＨＰＬＣ纯化．活性分析结果表明，Ｋ３被Ａ取代后ＨＷＴＸ－Ⅰ的生物活性下降了８０％。

虎纹捕鸟蛛毒素-I单残基突变体R20 A-HWTX-I的化学合成与性质分析

虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (Huwentoxin Ⅰ ,HWTX Ⅰ )是从虎纹捕鸟蛛 (Selenocosmiahuwena)的粗毒中分离出的一种多肽类神经毒素。为了探明该毒素分子中唯一的Arg残基与其生物学活性的关系 ,运用固相多肽合成技术和Fmoc化学直接构建了Ala取代HWTX Ⅰ第 2 0位Arg(R2 0 )的突变体R2 0A HWTX Ⅰ ;将合成的突变体置于含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化复性后用反相和特殊设计的离子交换HPLC纯化 ,并对之进行氨基酸组成、Edman降解与质谱分析。活性测定结果表明 ,HWTX Ⅰ分子中的R2 0被A取代后 ,活性下降了 92 % ,提示R2 0是与活性密切相关的重要残基。

虎纹捕鸟蛛毒素提取的研究

为探索提取广西产虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)毒素的新方法,选取雌性虎纹捕鸟蛛225只,根据提取方法(直接咬软管法、直接咬瓶法、激怒咬渐法激怒咬瓶冲洗法)分为4组,结果表明,采用直接咬软管法提取虎纹捕鸟蛛毒素,平均每只蜘蛛可以获得冻干毒素2.28 mg,与采用直接咬瓶法所获得的2.19 mg没有显著差异(P>0.05)。采用激怒咬瓶冲洗法提取虎纹捕鸟蛛毒素,平均每只蜘蛛可以获得冻干毒素重量明显高于激怒咬瓶法[(3.41±0.40)mg,(2.99±0.35)mg,P<0.05],亦明显高于直接咬软管法和直接咬瓶法。该试验结果表明,激怒咬瓶冲洗法是一种提取虎纹捕鸟蛛毒素的有效方法。

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ中组氨酸残基的修饰与活性的关系

用焦碳酸二乙酯 (DEPC)对虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ (HWTX Ⅰ )分子中的组氨酸残基进行了修饰 .修饰后的产物用高压液相色谱分离后采用质谱及氨基酸组成分析等相关技术进行鉴定 ,结果表明 ,DEPC对HWTX Ⅰ的修饰产生了咪唑环的单取代和咪唑环的双取代两种产物 .对修饰后的两种产物测定了对小鼠膈神经膈肌接头传递的影响 ,与天然的HWTX Ⅰ比较 ,组氨酸修饰后的HWTX Ⅰ其活性下降了 92 % ,证明组氨酸残基是HWTX

部分还原和分步序列测定法定位虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ二硫键

结合部分还原和分步序列测定法确定了虎纹捕鸟蛛毒素 - 的二硫键配对方式 .在 p H=3和 40℃的条件下与还原剂三羧甲基磷酸 ( TCEP)反应 1 0 min,利用 RP-HPLC分离并分别收集含有一对和两对二硫键被还原的中间体 ,分别与 0 .5 mol/L碘乙酰胺溶液 ( p H=8.3 )反应 1 min,使游离巯基烷基化后 ,测定各中间体的氨基酸序列 ,从而确定虎纹捕鸟蛛毒素 - 的 3对二硫键分别为 Cys2 -Cys1 7,Cys9-Cys2 4和Cys-Cys 3 1 ( 1 -4,2 -5和 3 -6) .

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体A1Y-HWTX-Ⅰ的固相合成和生物学活性测定

用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相多肽合成的方法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了用酪氨酸 (Y)替代虎纹捕鸟蛛毒素 - (HWTX- )第一位丙氨酸 (A1 )的突变体 A1 Y- HWTX- .合成的突变体用 Edman降解和电喷雾质谱法进行鉴定 .活性分析结果证明 ,合成的 A1 Y- HWTX- 在含有谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠后显示出与天然 HWTX- 完全相同的生物学活性 ,提示 Y替代 HWTX- 的 A1后并不明显影响 HWTX- 的活性部位和空间构象 ;A1与 HWTX- 生物学活性无关 .此外 ,将 Y引入 HWTX- 分子有助于利用碘标记方法研究 HWTX-

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的二硫键定位分析

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ是从虎纹捕鸟蛛毒液中分离得到的一种昆虫毒素 .它含有 35个氨基酸残基 ,其中 6个半胱氨酸形成三对二硫键 .首先采用多酶将天然的肽链裂解后 ,通过MALDI TOF质谱分析酶解肽段 ,推断出 1对二硫键位于Cys9 Cys2 1,然后利用改进的部分还原分步测序法 ,确定虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的另外 2对二硫键的配对方式为Cys2 Cys16和Cys15 Cys2 8.因此 ,虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的 3对二硫键分别以Cys2 Cys16 ,Cys9 Cys2 1,Cys15 Cys2 8(即 1 4、 2 5和 3 6 )的方式配对 .

虎纹捕鸟蛛毒素对脑缺血模型大鼠海马肿瘤坏死因子凋亡通路的影响

背景:虎纹捕鸟蛛毒素经离子通道分析技术证明是一种作用于突触前膜的N型钙离子通道阻断剂。目的:观察新型钙通道拮抗剂虎纹捕鸟蛛毒素对全脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马组织肿瘤坏死因子凋亡通路中肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase 8表达的影响。方法:采用Pulsinelli"四血管阻断法"构建全脑缺血结合蛛网膜下腔置管大鼠模型,通过留置的PE10管注入虎纹捕鸟蛛毒素或生理盐水。应用电镜、RT-PCR实验技术检测全脑缺血再灌注损伤大鼠海马CA1区锥体细胞超微结构和胞内线粒体形态变化及对海马组织中肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase 8等肿瘤坏死因子凋亡通路相关因子基因表达。结果与结论:虎纹捕鸟蛛毒素能维持全脑缺血再灌注脑损伤大鼠线粒体基本形态且能不同程度降低肿瘤坏死因子凋亡通路中促凋亡因子肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase 8 mRNA表达。提示天然活性多肽虎纹捕鸟蛛毒素作为一种新型N-型电压依赖性钙通道阻断剂,能有效阻断胞外Ca2+的大量内流,使细胞内游离钙降低,减少由于细胞内钙超载而引起的一系列病理损害,从而保护神经细胞,减轻缺血缺氧海马神经细胞的损伤。

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ天然突变体的分离纯化与鉴定

通过离子交换及反相HPLC,从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到一种虎纹毒素-Ⅰ天然突变体,MALDI-TOF质谱仪分析表明该多肽天然突变体分子量为3 636 Da.Edman测序结合串联质谱和氨基酸组成分析鉴定出该天然突变体的序列为H2N-ACKGV FDACT PGKNE CCPNR VCSDK HKWCK WQ-COOH.其中6个Cys形成3对二硫键.小鼠脑室注射实验表明,该天然突变体能使小鼠致死,但不能阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递.本研究结果表明,K32残基对于HWTX-Ⅰ的生物学活性有关键性作用.

虎纹捕鸟蛛毒素的抗菌活性探讨

从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到 2种多肽毒素 ,huwentoxin -Ⅰ和huwentoxin -Ⅱ。抗菌实验结果表明 ,这 2种多肽毒素能抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及啤酒酵母菌的生长 。

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ cDNA克隆及序列

从中国珍稀毒蛛种虎纹捕鸟蛛 (Selenocosmia huwena)毒腺中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素 - (Huwentoxin ,HWTX- ) ,其一级结构、二级结构和溶液构象均已阐明 ,生理功能实验已证实 HWTX- 是一种作用于突触前膜的神经毒素和高阈值钙通道抑制剂 .为深入开展对 HWTX- 的应用研究 ,根据 HWTX- 多肽氨基酸序列 ,设计其 N-端、C-端和中间段 3组简并引物 (引物 、引物 和引物 ) .从虎纹捕鸟蛛毒腺提取制备 m RNA,逆转录合成 c DNA.以引物 和引物 为引物 ,采用 PCR方法对虎纹捕鸟蛛毒腺总 c DNA进行简并引物扩增 ,得到两条相对特异性的 DNA片段 ,产物直接与 PCR克隆载体 p UC- T连接 .重组子经原引物再次 PCR扩增和同位素标记引物 进行 Southern分子杂交鉴定 .对 4个重组子测序结果表明 ,有 1个重组子所对应的氨基酸顺序与 HWTX- 一致 ,Gen Bank数据检索说明 HWTX- c DNA编码序列确实是一个从未报道的序列 .本研究结果为 HWTX- 在真核细胞表达 ,大量获取蜘蛛毒素组分奠定了基础 .

虎纹捕鸟蛛毒素对人结肠癌SW480细胞体外增殖的影响

目的探讨虎纹捕鸟蛛毒素对结肠癌SW480细胞体外增殖的影响。方法以体外培养的人结肠癌SW480细胞株为实验模型,以不同浓度的虎纹捕鸟蛛毒素对SW480细胞进行体外干预,通过MTT药物敏感实验检测其抑制率及计算IC50;镜下观察经Hoechst 33342染色后的细胞形态变化;流式细胞仪观测经AnnexinⅤ-FITC/PI双染的细胞状态的变化;分光光度法测定Caspase-3的相对活化倍数的变化。结果 MTT药物敏感实验显示,5～100 mg/ml虎纹捕鸟蛛粗毒对人结肠癌SW480细胞有抑制作用,且呈一定剂量效应关系。其48 h半抑制浓度(IC50)为43.68 mg/ml;显微镜下可见虎纹捕鸟蛛粗毒干预后的SW480细胞数量明显减少,细胞形态各异,并出现细胞碎片;流式细胞结果显示:10 mg/ml虎纹捕鸟蛛粗毒诱导的SW480细胞凋亡率最高,达(57.66±20.44)%;50 mg/ml虎纹捕鸟蛛粗毒干预后,SW480细胞坏死率最高,达(25.36±15.03)%;100 mg/ml虎纹捕鸟蛛粗毒干预后Caspase-3活化最明显。结论虎纹捕鸟蛛粗毒对人结肠癌SW480细胞体外增殖具有抑制作用。

虎纹捕鸟蛛毒素-ILys13突变对生物学活性的影响

从虎纹捕鸟蛛Selenocosmia(Ornithoctonus)huwena的粗毒中分离纯化出来的虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)是一种多肽类神经毒素。为了进一步探明其结构与功能的关系,采用以固相多肽合成为核心技术的蛋白质工程方法直接构建了Ala取代Lys13的单残基突变体K13A-HWTX-Ⅰ,并同时合成了HWTX-Ⅰ的全序列sHWTX-Ⅰ作实验对照。合成产物经质谱和序列分析鉴定无误后在含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠并用离子交换和RP-HPLC纯化。活性测定结果表明,氧化复性后,sHWTX-Ⅰ与天然HWTX-Ⅰ的生物学活性完全相同,而K13A-HWTX-I的生物学活性下降了87％,提示Lys13是与HWTX-Ⅰ的生物学活性密切相关的重要残基。

虎纹捕鸟蛛毒素-X的化学合成及其鉴定

应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了虎纹捕鸟蛛毒素-X(huwentoxin-X,HWTX-X),并在含5mmol/L GSH和0.5mmol/L GSSG的0.1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)中氧化复性;复性产物与天然多肽具有相同的分子质量,在反相HPLC上共洗脱,其一维核磁共振谱规则分散,表明合成多肽形成了3对二硫键和稳定的空间结构,并与天然多肽相同;此合成的多肽能专一性抑制大鼠背根神经节细胞上N-型电压敏感钙离子通道,其IC50约40nmol/L.HWTX-X的成功合成和鉴定为进一步研究HWTX-X的结构与功能关系、药理学性质以及新型镇痛药物研发奠定了基础.

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ去折叠过程的色谱分析

将纯化的天然虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅴ经盐酸胍变性 30min后 ,在pH 3 0、反应温度为 37℃的条件下与三羧甲基磷酸 (TCEP)反应 12min ,用反相高效液相色谱分离得到其全部去折叠中间体 ,通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进行鉴定 ,并利用烷基化反应对这些去折叠中间体予以进一步确证。根据其保留时间 ,分析虎纹毒素 Ⅴ各去折叠中间体的色谱行为 ,初步探讨了多肽或蛋白质构象异构体反相色谱行为的多样性。