虎纹蛙病毒甲基转移酶基因的克隆和分析

经PCR扩增得到虎纹蛙病毒DNA甲基转移酶完整基因片段 ,并将其克隆到pUCm -T载体 ,测序可知该基因读码框大小为 6 4 2bp ,编码一由 2 14个氨基酸组成的、预期分子量为 2 4 .8kD的多肽。RTV的MTase基因与蛙病毒属的蛙病毒 - 3型、叉尾病毒和Regina病毒的一致性为 96 %～ 97% ,与淋巴囊肿病毒属的比目鱼病毒的一致性为 5 6 % ,从而进一步证明RTV蛙病毒的分类地位 ;与其它脊椎动物的虹彩病毒一样 ,该基因包含原核生物 5’甲基转移酶的前四个高度保守区而缺少第五个区域 ,可能只是构成甲基转移酶的一个亚基 ;RTV、裂唇鱼病毒和大口黑鲈病毒之间MTase基因的一致性与衣壳蛋白基因的差异较大 ,说明同一种类的不同基因甚至同一基因的不同区域间演化速率不同 。

虎纹蛙病毒的ATP酶基因克隆和序列分析

利用对应于蛙病毒-3型(FV3)ATP酶基因(ATPase)的162-178 nt和1 186-1 174nt碱基序列作为引物,采用PCR方法扩增得到虎纹蛙病毒(RTV)的ATP酶基因,并对该基因进行克隆、测序和分析.基因读码框大小为945bp,预计可编码一相对分子质量为35 500的蛋白质.氨基酸序列比较结果,RTV的ATPase基因与虹彩病毒科蛙病毒属的代表种FV3的一致性最高,为87.9%,与该科其它脊椎动物病毒的一致性在50%～52%之间.ATP酶蛋白质结构域分析可知该基因编码的ATP酶含有Walker型ATP酶AAA族蛋白质的全部结构域,其中既具有Walker型ATP酶所具有的Walker A和Walker B保守区,还含有AAA族蛋白质基因所具有的SRH高度保守区,因此,该基因是一完整的活性蛋白编码基因.

蛙虹彩病毒巢式PCR检测方法的建立

蛙虹彩病毒属(Ranavirus)病毒宿主广泛,可以感染爬行类、鱼类和两栖类,大部分病毒对宿主都有较强的致病性和致死性。为建立一种快速高效的蛙虹彩病毒的检测方法,本研究利用中华鳖虹彩病毒(Soft-shelled Turtle Iridovirus,STIV)核衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因保守区设计内引物和外引物,建立了特异性检测流行性造血器官坏死病毒(Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus,EHNV)、中华鳖虹彩病毒和虎纹蛙虹彩病毒(Tiger Frog Virus,TFV)的巢式PCR(巢式PCR)检测方法,并制备了重组质粒pGem-T-S作为阳性对照标准品。检测限试验结果显示,该方法可以检测102拷贝的病毒粒子。而且与传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒、病毒性出血性败血症病毒、斑点叉尾病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒、牙鲆弹状病毒以及锦鲤疱疹病毒等其他非蛙虹彩病毒无交叉反应。该体系具有简便、快速、敏感、特异性高、低成本等特点,为诊断与预防蛙虹彩病毒提供了一项重要的技术手段。