基于结构计算设计提高费氏弧菌LuxR蛋白转录激活能力的策略

采用理性设计策略提高费氏弧菌转录因子LuxR蛋白的转录激活能力。利用蛋白质建模和分子对接方法构建了LuxR同源二聚体-3-oxo-C6-HSL复合物,进一步采用分子动力学模拟并进行结合自由能分析,寻找影响LuxR活性的潜在突变位点,最终借助虚拟饱和突变筛选有利突变体,并通过构建LuxR突变质粒验证突变体的转录激活能力。研究结果显示,Ser54对LuxR二聚化有重要影响,而虚拟饱和突变提示S54L、S54F、S54W与S54Y 4个突变能够提升LuxR二聚体的稳定性,这可能有助于提升其转录激活能力;实验验证发现当3-oxo-C6-HSL的浓度为10^(-5)mol/L时,S54W和S54L能够将LuxR的活性提高至WT的1.4倍。成功利用计算机辅助设计技术筛选出高活性LuxR突变体,为LuxR蛋白家族以及其他二聚体蛋白的改造提供新思路。

基于柔性区域的计算设计改造玉米赤霉烯酮水解酶热稳定性

来源于粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea的玉米赤霉烯酮水解酶(ZHD101)可以有效降解谷物农副产品和饲料中的霉菌毒素玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN),但是,该酶的热稳定性较低,限制了其在工业中的应用。由于水解ZEN的反应没有吸光值的变化,不适合高通量筛选。本文以ZHD101为模式酶,进行计算虚拟突变并结合实验验证。通过比对不同温度下的分子动力学模拟轨迹,选取32个柔性位点;再通过位置特异性评分和酶构象自由能计算,从32个柔性位点上的608个虚拟饱和突变体中筛选出12个突变体。经实验验证,其中3个突变体N156F、S194T和T259F的热熔融温度有一定程度的提升(ΔT_(m)>4℃),且酶活性与野生型类似甚至更高(相对酶活性为95.8%、131.6%和169.0%)。分子动力学模拟分析显示,导致3个突变体热稳定性提高的可能作用机理分别为NH-π作用力、盐桥重排和分子表面空穴填充。将3个突变体进行迭代组合突变,N156F/S194T表现出最高的热稳定性(ΔT_(m)=6.7℃)。这项工作表明基于柔性区域的虚拟饱和突变在酶稳定性改造上的可行性,探索计算虚拟改造结合实验验证的酶改造策略。