日本血吸虫P7抗原的克隆表达、虫期特异性分析以及早期诊断价值的研究

目的克隆表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)P7抗原片段(GenBank登录号为EU121231),研究各虫期中该目的片段的转录和表达情况,初步评价其作为早期诊断抗原的潜力。方法将日本血吸虫童虫cDNA文库中免疫筛选出的阳性克隆P7进行体外扩增,将目的基因亚克隆至原核表达载体pET28a中。用双酶切的方法鉴定重组质粒,将阳性重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化。用蛋白质印迹(Western blotting)分析初步鉴定表达产物的免疫诊断价值。利用逆转录PCR和Westernblotting分析检测P7片段在日本血吸虫各个虫期中的转录和表达情况。以P7重组蛋白为抗原用间接ELISA检测感染日本血吸虫后14 d的兔血清(18份),日本血吸虫病(28份)、华支睾吸虫病(30份)和卫氏并殖吸虫病(20份)患者血清,以及健康人血清(30份),计算特异性和敏感性。结果成功构建了重组表达载体P7/pET28a,并在E.coli中表达。Western blotting分析结果显示P7重组蛋白能被感染日本血吸虫后14 d的小鼠血清和P7重组蛋白免疫的多抗兔血清识别,但不能被感染后42 d的小鼠血清识别,蛋白相对分子质量(Mr)约为20 100。采用逆转录PCR技术在尾蚴、童虫和成虫中均检测到了P7片段的mRNA。Western blotting分析结果显示,仅在童虫阶段检测到目的蛋白。间接ELISA检测感染早期兔血清的检出率为83.3%(15/18),检测日本血吸虫病患者血清的敏感性为75.0%(21/28),特异性为93.8%(75/80),与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清的交叉反应分别为6.7%(2/30)和5.0%(1/20)。结论日本血吸虫P7抗原可能为潜在的日本血吸虫病早期诊断的靶分子。

印鼠客蚤各虫期发育与温度关系的研究

印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)是家鼠鼠疫自然疫源地主要宿主动物黄胸鼠的主要体表寄生蚤,也是鼠疫菌自然感染率最高的蚤种。以往研究证明,印鼠客蚤是云南家鼠鼠疫疫源地内具有二次菌栓形成能力及高效能的主要媒介。为探索该蚤的规范化养殖,了解其生物学特性,于1996年对印鼠客蚤各虫期经不同温度养殖的发育和存活情况进行了观察。1 材料与方法1.1 蚤种 印鼠客蚤系1989年采自大理市黄胸鼠及褐家鼠鼠体,经实验室养殖的纯系品种。1.2

日本血吸虫肌球蛋白调节轻链的原核克隆表达及虫期转录特异性

目的在原核系统中克隆表达日本血吸虫肌球蛋白调节轻链(SjMRLC)并分析其基因的虫期转录特异性。方法根据SjMRLC的核苷酸序列(GenBank登录号为AY815219)设计特异性引物,PCR扩增目的基因,并克隆入原核表达载体pGEX4T-3;转至大肠埃希菌BL21株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;蛋白质印迹分析(Western blotting)鉴定表达产物;提取日本血吸虫各虫期总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增分析SjMRLC基因的虫期转录特异性。结果构建pGEX 4T-3/SjMRLC重组质粒,测序表明插入的外源基因片段正确,诱导表达获得带有GST标签的可溶性蛋白(Mr49000);虫期转录特异性分析显示该基因在日本血吸虫各个虫期均有转录,且水平一致。结论成功获得可溶性的带有GST标签的SjMRLC;SjMRLC是管家基因。

拟双棘长蠹的发现及其各虫期特征的观察

拟双棘长蠹Sinoxylon flabrarius Les.从泰国进口梨原木检疫中首次截获。由于此虫为害原木严重,在我国尚未有分布的报道,因此,作了熏蒸杀虫处理。为了加强检疫,做到快速准确检验,对各虫期特征进行了观察,并与S.anale Lesne近似种进行了比较。

影响杨小舟蛾种群数量发生变化的关键虫期分析研究

2015年南阳市在开展杨小舟蛾种群数量生命发育规律研究时,找到了影响杨小舟蛾第2、3、4代种群变化的关键虫期,并提出了相应的防治技术措施。

中红侧沟茧蜂滞育临界光周期和敏感光照虫态的测定

室内对中红侧沟茧蜂Microplitis mediator滞育诱导的光周期反应及敏感光照虫态进行了研究。结果表明：在16℃和18℃温度下,当光周期为10L∶14D时,中红侧沟茧蜂的滞育率最高为98%和87.8%;其次是光周期为8L∶16D时,滞育率为78.7%和73%;光周期为12L∶12D时,滞育率为55.8%和50.8%;而在全光照LL,光周期22L∶2D,20L∶4D,18L∶6D,16L∶8D,14L∶10D,2L∶22D和全黑暗DD时的滞育率均为0。中红侧沟茧蜂属于典型的长日照发育型,在16℃时诱导滞育的临界光周期是7.03L∶16.97D和12.21L∶11.79D;在18℃时是6.75L∶17.25D和12.03L∶11.97D。16℃时中红侧沟茧蜂对光照反应最敏感时期为2龄幼虫第5-8天,2龄幼虫第1-4,9-12和13-16天及3龄期次之,卵期和1龄幼虫不敏感。

光周期对梨小食心虫滞育诱导的影响

在实验室条件下对梨小食心虫滞育诱导的光周期反应和不同日龄幼虫对滞育诱导光周期的敏感性进行了研究。结果表明:梨小食心虫属于典型的短日照滞育型,在20℃条件下,当光周期为8L∶16D,10L∶14D和12L∶12D时,梨小食心虫的滞育率均达95%以上,诱导滞育的临界光周期为13.75L∶10.25D;在24℃条件下,当光周期为10L∶14D和12L∶12D时,滞育率均达95%以上,诱导滞育的临界光周期为13.68L∶10.32D。在幼虫期,分别给不同日龄幼虫以12L∶12D和16L∶8D光照处理后,在不同发育时间内幼虫对滞育诱导光周期反应均显示出一定程度的敏感性,无明显的临界时间点,但仍以第5—8日龄幼虫接受滞育诱导光周期反应更为敏感。

三带喙库蚊滞育的临界光周期与敏感虫期

当三带喙库蚊在实验条件下接触12.5h光照时,大约50%个体进入滞育,即临界光周期.没有光照时个体发生滞育较低,当滞育个体转到13.5h/天光照条件下超过4天时,50%左右个体解除滞育.各期幼虫、蛹、新羽化蚊及经产蚊由长光照分别改为短光照或者相反,检查雌蚊卵巢滤泡及吸血活动,发现短光照对各期幼虫、蛹及成蚊都具有影响,只要羽化后的成蚊继续保持短光照,滤泡发育与吸血活动就受抑.幼期阶段短光照处理,羽化的雌蚊改长光照后不能进入滞育.结果表明幼期阶段短光照处理与成蚊滞育的发生没有明显的关系,该蚊对临界光周期的敏感虫期为新羽化的成蚊.

香港海产贝类及其感染吸虫蚴虫期情况的分析

采用多样性指数和对应分析方法，对采自香港１４个地点的２２种海产贝类及其感染吸虫蚴虫期情况进行数量分析，研究海产贝类群体及其寄生吸虫蚴虫类群之间的生态关系。结果表明：在贝类—吸虫蚴虫期的统计调查中，最小样本量为贝类４０００，其中阳性贝类要３０个以上。由于自然选择的结果，使分布在大面积区域上的淡水及海产贝类群体及其感染吸虫蚴虫期的群落结构连续变化。随着贝类群落结构、数量组成复杂程度的增加，吸虫的多样性也增加，其结果将使群落的稳定性增加。

苏云金杆菌营养期杀虫蛋白的研究

营养期杀虫蛋白 (vegetativeinsecticidalproteins ,VIPs)是苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒蛋白。VIPs主要分为VIP1、VIP2和VIP3三种。VIP1和VIP2构成二元毒素 ,对鞘翅目叶甲科的昆虫具有杀虫特异性 ;而VIP3对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性。VIP1和VIP2的杀虫作用机理还不清楚 ;VIP3通过诱发细胞凋亡 ,最终导致昆虫死亡 ,这种作用机理与Bt杀虫晶体蛋白的作用机理完全不同 ,这为筛选新的杀虫活性物质提供了新的思路。vip基因现已被应用于转基因杀虫植物的构建 ,得到高效抗虫的多价转基因玉米。此外 ,VIPs嵌合蛋白的构建、vip及其融合基因导入其它许多宿主微生物等方面的研究也具有诱人的潜在应用前景。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因特性分析

营养期杀虫蛋白是在苏云金芽胞杆菌营养期中发现的一种非晶体状胞外杀虫蛋白 .通过Southern杂交的基因定位实验 ,证实了营养期杀虫蛋白基因并非位于染色体和环型质粒上 ;在 2 0个不同血清型的 2 3种菌株中 ,营养期杀虫蛋白基因的存在率为 5 6 5 % (13 2 3) .同时对随机选择的 3个不同亚种菌株进行基因克隆和序列分析 ,表明其基因具有相当高的同源性 .运用生物信息技术 ,对营养期杀虫蛋白多肽进行了功能结构域比对分析 ,发现这 789多肽蛋白的N端 31至 15 0残基之间存在一种趋化信号传导因子相似序列 ,C端 5 36至 6 6 6残基之间则存在着纤维素结合结构域相似肽 .上述结果提示 ,营养期杀虫蛋白基因在苏云金芽胞杆菌天然菌株中高度保守并较为广泛分布 ,其编码蛋白的特殊结构提示了营养期杀虫蛋白潜在的功能特性 ,为进一步研究营养期杀虫蛋白奠定了基础 .

苏云金杆菌辅助蛋白P20对营养期杀虫蛋白Vip3A表达的影响

为检测苏云金杆菌辅助蛋白P20对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20基因与vip3A基因相连构建了重组质粒pHVP20,然后电激转化至Bt中进行了共表达,以仅携带vip3A基因的质粒pHPT3作为对照质粒。Westernblot结果显示,当vip3A基因和p20基因在Bt无晶体缺陷株CryB中共表达时,Vip3A蛋白的最大表达量约是其在CryB(pHPT3)菌株中单独表达的1.5倍。生物测定结果表明,CryB(pHVP20)和CryB(pHPT3)菌株对初孵斜纹夜蛾幼虫的LC50值分别为48.79μg/mL和78.00μg/mL,这说明P20蛋白可以促进vip3A基因在Bt中的表达,但对提高Vip3A蛋白的杀虫毒力没有显著性帮助。

Bacillus thuringiensis营养期杀虫蛋白Vip3与其转基因植物研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中,最主要的是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)和营养期杀虫蛋白(Vegetative insectici-dal protein,Vip)。当前,大部分商业化利用的转基因作物均为杀虫晶体蛋白类,随着这些转基因作物种植面积的扩大,害虫对这些较为单一的杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。Vip3是Vip杀虫蛋白中的一类,不形成蛋白晶体,和ICPs在进化上没有同源性;其对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等害虫具有毒杀作用,抗虫谱较广。目前,已经把Vip3基因导入了水稻、玉米和棉花等多种作物中,为作物抗虫育种、延缓害虫产生抗性和减少作物产量损失等带来新的前景。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3研究进展

营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein,VIP)是由苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为VIP1、VIP2和VIP3三种,以VIP3的研究最为深入。VIP3A对鳞翅目害虫具广谱杀虫活性,可作用于敏感昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊致离子通道的形成,杀虫活性达纳克级水平。利用BtICPs不同启动子与vip3基因重组可提高VIP3蛋白的表达量和稳定性。转vip3基因植物也已有构建成功的报道。本文从VIP3的类型和杀虫活性、作用机理、vip3基因的定位和分离、vip3基因重组和转vip3基因植物等方面详细介绍了VIP3近十年来的研究进展。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用

将构建的营养期杀虫蛋白基因vip83表达质粒pBMB2 32 8和含杀虫晶体蛋白基因(cry1Ac1 0或cry1Ca)质粒同时电转化无质粒突变株BMB1 71并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证 ,分别得到含cry1Ac1 0和vip83、cry1Ca和vip83的双基因重组菌BMB2 830 1 71和BMB2 882 1 71。用单基因重组菌作对照 ,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白Cry1Ac1 0和Cry1Ca两组蛋白对 3种重要鳞翅目害虫毒力。经统计分析 ,结果表明两组杀虫蛋白Vip83与Cry1Ac1 0和Vip83与Cry1Ca之间对棉铃虫均存在拮抗作用 ,对甜菜夜蛾协同作用不明显 ;但对小菜蛾前者协同作用不明显 ,而后者则有增效作用 ,其共毒系数为32 6。双基因的遗传稳定性检测表明这种正负协同关系具有一定的分子遗传稳定性 。

苏云金杆菌营养期蛋白杀虫活性及Vip3A-LS1基因克隆

对营养期高活性杀虫菌株进行筛选,得到高效菌株BtLS1,对其营养期杀虫蛋白活性及发酵特性进行了系统研究,克隆了该菌株的vip3A新基因。测定了31株vip3A基因阳性菌株营养期杀虫蛋白的活性,发现BtLS1和BtLS8菌株对甜菜夜蛾Spodopteraexigua生长的抑制作用明显高于其他菌株。进一步研究表明,BtLS1菌株营养期杀虫蛋白对初孵和2龄甜菜夜蛾幼虫的体重增长抑制率分别为95.3%±2.1%和90.7%±6.6%;对棉铃虫Helicoverpaarmigera初孵幼虫的校正死亡率为22.1%,对2龄幼虫的体重增长抑制率为78.7%±6.6%。发酵液中以胞内可溶性物质为主。设计vip3A全长基因特异引物PCR扩增,插入质粒pBluescriptSK(+),克隆测序证实该菌株中存在vip3A新基因,命名为Vip3A-LS1,GenBank登录号为DQ016968。按该序列推断的蛋白与同类蛋白的8个氨基酸之间存在差异。