重组酶介导等温核酸扩增技术检测细粒棘球绦虫方法的建立及初步应用评价

目的建立一种新的敏感、特异且能快速检测细粒棘球绦虫G1的重组酶介导扩增技术(Recombinase aided isothermal amplification,RAA)。方法以细粒棘球绦虫G1(E.granulosus G1,EgG1)线粒体基因序列(GenBank No.AF297617)作为靶序列设计合成引物,以EgG1 DNA为模板进行RAA扩增,反应产物预期大小为284 bp。以聚合酶链式反应(PCR)作为平行对照,应用RAA扩增不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的含目的基因片段不同拷贝数的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测方法的检测灵敏度;应用此方法检测多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、贾第鞭毛虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价方法的特异性。方法优化后用于检测感染EgG1的动物组织标本(10份)、模拟现场阳性犬粪标本(3份)以及现场阳性犬粪标本(5份),以验证该项检测技术的可靠性和实用性。结果建立的RAA法可在40 min内特异性扩增EgG1的目的基因片段,最低可检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低检出质粒拷贝数为104个。用建立的RAA法检测其他寄生虫(包括多房棘球绦虫)结果均为阴性。用优化的RAA方法检测感染EgG1的动物组织标本以及阳性粪便标本(包括模拟现场粪便标本),结果均为阳性,且与PCR检测结果一致。结论建立的针对EgG1的RAA方法,其具有简便快捷、检测灵敏度与特异性均较好的特点,可望用于细粒棘球绦虫虫种的鉴定以及棘球蚴病基因诊断。