高虫草素含量蛹虫草菌的复合诱变选育研究

蛹虫草菌是冬虫夏草的近缘种,简称蛹草,不仅含有种类齐全、含量比例适宜的人体必需氨基酸,还含有大量腺苷、虫草素、腺嘌呤,是食药两用的虫草属真菌。其中,虫草素具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗癌等功效,是蛹草中重要的活性成分。不同蛹草菌产虫草素能力不同,本文采用LiCl、60Coγ复合诱变,对1株蛹草菌原始菌株进行诱变,考察了LiCl不同质量浓度、60Coγ射线不同辐照剂量对诱变菌株致死率、突变率的影响,并用高效液相色谱法对筛选出的稳定突变体发酵液中的虫草素含量进行测定,筛选出高产虫草素突变体1株,虫草素含量达2.64mg/mL,为蛹虫草菌的进一步改良提供了一定的参考依据。

北虫草饮品配方优化及其理化特性

以北虫草粉为主要原料,添加麦芽糖醇、羧甲基纤维素钠、柠檬酸和D-异抗坏血酸钠制作北虫草饮品。通过单因素试验和响应面试验对北虫草饮品的配方进行优化,测定酸价、过氧化值等指标。最佳工艺条件结果表明:羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量为0.04%,北虫草粉添加量为9.5%,麦芽糖醇和木糖醇添加量为6.4%,柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量为0.25%,该条件下,各项理化性质均符合饮品的质量和卫生指标,北虫草饮品的差异性化合物主要有虫草素、苏氨酸、甲硫氨酸。

爪哇虫草菌JS001浸种处理对水稻生长和防御褐飞虱的影响

【目的】明确新登记的真菌杀虫剂爪哇虫草菌Cordyceps javanica JS001在调控水稻生长和防御褐飞虱Nilaparvata lugens中的作用。【方法】室内分别用1×10^(4),1×106和1×10^(8)孢子/mL爪哇虫草菌JS001孢子悬浮液浸泡水稻种子48 h,以0.01%Triton X-100溶液浸种为对照,待培养8 d后,对水稻苗进行生长测定,并测定褐飞虱成虫对其的行为选择反应;通过气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)分析1×10^(8)孢子/mL爪哇虫草菌JS001孢子悬浮液浸种对水稻苗次生代谢化合物含量的影响。采用1×10^(7)孢子/mL爪哇虫草菌JS001孢子悬浮液和清水(对照)分别浸泡水稻种子48 h,于种子直播50 d后,调查稻田中稻飞虱和蜘蛛个体数量。【结果】室内测定结果表明,与对照相比,1×10^(6)和1×10^(8)孢子/mL爪哇虫草菌JS001孢子悬浮液浸种处理不仅显著促进水稻种子发芽、水稻苗根和茎叶的生长,而且降低褐飞虱成虫对水稻苗的选择性。化合物分析结果表明,与对照相比,1×10^(8)孢子/mL爪哇虫草菌JS001孢子悬浮液浸种处理的水稻苗中防御性化合物过氧化氢、油酸、辛烷等含量显著增加,能吸引褐飞虱的化合物2-壬酮含量显著降低。田间试验结果表明,与对照相比,1×10^(7)孢子/mL爪哇虫草菌JS001孢子悬浮液浸种显著降低稻田中稻飞虱数量,但对捕食性天敌蜘蛛个体数量无影响。【结论】爪哇虫草菌JS001浸种处理不但能促进水稻苗的生长,而且能提高水稻对褐飞虱的防御能力。田间试验进一步明确了爪哇虫草菌JS001在增强水稻防御稻飞虱危害中的作用。这些结果可为爪哇虫草菌的应用及稻飞虱生物防治策略的制定提供新途径。

蛹虫草菌株胞外发酵液抗氧化能力评价及优良菌株筛选

为建立高抗氧化能力的蛹虫草优良菌株评价筛选方法,以蛹虫草(Cordyceps militaris)胞外发酵液为研究对象,采用相关性分析对10株蛹虫草菌株进行抗氧化能力评价及优良菌株筛选。以菌株生长活性、胞外酶活力、抗氧化能力为指标,在相关性分析、隶属函数赋值计算的基础上建立线性回归方程,得到蛹虫草菌株抗氧化综合能力与发酵生物量、菌丝平均生长速度、β-葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力的蛹虫草菌株定向筛选模型,采用模型筛选得到优势菌株CH-1及CA-1。通过结实性实验进一步验证,蛹虫草菌株CH-1与CA-1生物学转化率可达90%以上,其虫草素含量较野生菌株高60%左右,菌株生长周期短10 d以上,试验结果说明此模型可用来快速筛选出具有高抗氧化能力的蛹虫草优良菌株。

不同种类氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响

[目的]研究液体培养基中添加氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响,并确定8种氨基酸最佳添加浓度。[方法]考察24种氨基酸(添加浓度为1 g/L)对虫草素含量的影响,采用DPS V18.10软件进行差异显著性分析,并对促进虫草素合成作用显著的8种氨基酸添加浓度进行研究。[结果]L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、肌氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量具有不同程度的提高作用;4 g/L的L-甘氨酸对虫草素的合成促进作用最强,发酵液中虫草素含量为1022.25 mg/L。[结论]该研究为蛹虫草液体发酵生产虫草素提供参考依据。

虫草素及其代谢物3′-脱氧肌苷在大鼠体内的药动学

目的建立血浆虫草素及代谢物3’-脱氧肌苷(3′-Deo)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定方法,研究其在大鼠体内的药动学。方法以2-氯腺苷(2-Chl)为内标,甲醇沉淀蛋白,色谱柱为Kinetex C18(3 mm×100 mm,2.6μm),流动相为水(5 mmol·L^(-1)乙酸铵)-甲醇溶液,梯度洗脱。电喷雾离子源,正离子多反应监测。研究大鼠灌胃虫草素(10 mg·kg^(-1))后血浆虫草素及3′-Deo药动学。结果虫草素和3′-Deo分别在0.5~100和1~200 ng·mL^(-1)范围内线性关系良好,定量下限分别为0.5和1 ng·mL^(-1)。大鼠灌胃虫草素后,血浆虫草素浓度较低,主要转化为3′-Deo。虫草素和3′-Deo的峰浓度(C_(max))分别为(5.4±3.4)和(142.0±50.0)ng·mL^(-1),血药浓度-时间曲线下面积(AUC_(0-360 min))分别为(658.4±459.3)和(18034.9±4981.1)ng·min·mL^(-1)。结论该方法简单、灵敏、准确,适用于虫草素与3′-Deo血药浓度测定及药动学研究。

柞蚕蛹虫草不同培养时间中的活性物质代谢组分析

为解析柞蚕蛹虫草不同培养时间中活性代谢物的种类及积累规律,运用广泛靶向代谢组学技术对培养0、10、20、30、40 d的柞蚕蛹虫草中的代谢物进行鉴定。结果表明,柞蚕蛹虫草不同培养时间中的主要活性物质种类大体相同,在各试验培养期中分别鉴定出419、419、420、417和417个代谢物,主要包括氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、酚酸、有机酸、糖及醇类、脂类、生物碱等多种化合物。其中,首次检测到3-吲哚丙酸、吡哆素。柞蚕蛹虫草培养过程中差异代谢物的相对含量差异显著,所有的差异代谢物聚为9个簇,大致分为5种类型,其中,有61个代谢物在试验期内呈现持续上调趋势,包括虫草素、2-脱氧腺苷等。对比主要活性物质中6种核苷类成分及鲜味氨基酸含量,培养40 d的柞蚕蛹虫草品质更佳。

参七虫草方通过ASS1/src/STAT3信号通路改善肺纤维化大鼠的炎症反应

目的观察参七虫草方对肺纤维化大鼠精氨酸琥珀酸盐合成酶-1(ASS1)/src酪氨酸激酶(src)/信号转导和转化激活因子3(STAT3)通路相关因子表达的影响,探讨其治疗肺纤维化的作用机制。方法选择120只SPF级SD雄性大鼠,采用随机数字表法分为5组:空白组、模型组、参七虫草方组、吡非尼酮组、精氨酸脱亚胺酶(ADI)腹腔注射组(24只/组)。除空白组以外,4组均使用一次性气管内滴注博来霉素(BLM)诱导制备特发性肺纤维化的大鼠模型。造模成功后,参七虫草组予参七虫草方汤剂(0.423 g/kg)灌胃;吡非尼酮组予溶于生理盐水的吡非尼酮胶囊粉末(10 mL·kg^(-1)·d^(-1))灌胃2次;ADI腹腔注射组予以2.25 mg/(kg·d)腹腔注射,1次/3d;空白组、模型组分别以10mL/(kg·d)生理盐水灌胃;给药疗程28d。于第7、14、21、28天分4批处死大鼠,分离肺组织并计算肺指数。采用苏木素-伊红、马松染色观察大鼠肺组织的组织病理学;吉姆萨染色分析BALF中不同种类的炎症细胞;采用酶联免疫吸附测定法检测血清趋化因子配体2(CCL2)、转化生长因子β1(TGF-β1)的含量;蛋白免疫印迹法测定肺组织src、p-src^(Try529)、STAT3、p-STAT3^(Try705)的蛋白表达;采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测肺组织ASS1、src、STAT3的表达水平。结果参七虫草组、吡非尼酮组和ADI腹腔注射组各时间点中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞均低于同一时间点的模型组(P<0.05)。在相同时间点,参七虫草组、吡非尼酮组和ADI腹腔注射组大鼠血清CCL2、TGF-β1水平均低于模型组(P<0.05)。参七虫草组、吡非尼酮组和ADI腹腔注射组的p-src^(Try529)、p-STAT3^(Try705)蛋白表达水平及肺组织ASS1、src、STAT3mRNA均低于同一时间点的模型组(P<0.05)。结论参七虫草方可以缓解大鼠的肺纤维化程度,其机制可能通过调控ASS1/src/STAT3信号通路的活化从而缓解BLM大鼠肺纤维化的炎症反应。

短期服用蛹虫草对不同状态小鼠的免疫调节作用

为研究短期服用蛹虫草对不同状态小鼠的免疫调节作用,探讨其作为免疫调节剂的应用价值,将KM系小鼠随机分为低倍组(DB组)、高倍组(GB组)和对照组(CK组),DB组和GB组连续灌胃不同剂量蛹虫草水溶液21 d,CK组灌胃同等剂量蒸馏水。测定小鼠体质量、脏器指数、血清免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G、IgM、白细胞介素(interleukin,IL)-2和IL-10含量,外周血CD3^(+)CD4^(+)和CD3^(+)CD8^(+)T淋巴细胞亚群含量,肠道菌群组成结构及空肠Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2、TLR4、髓样分化因子88及核因子(nuclear factor)-κB表达量的变化。腹腔注射80 mg/kg mb环磷酰胺溶液诱导小鼠免疫抑制状态,在蛹虫草水溶液灌胃的第0、7、14、21天取材检测。结果显示,不同剂量蛹虫草对小鼠体质量、脏器指数、血清IgG、IgM、IL-2和IL-10水平、外周血CD3^(+)CD4^(+)和CD3^(+)CD8^(+)T淋巴细胞亚群含量均未产生显著影响(P>0.05)。蛹虫草可以上调小鼠肠道菌群Shannon指数和操作分类单元数量,增加肠道菌群多样性和丰富度。肠道益生菌Lactobacillus和Alistipes相对丰度明显升高(P<0.05),炎症促生菌Clostridium XIVa、Helicobacter及Lachnospiracea_incertae_sedis相对丰度显著降低(P<0.05)。不同剂量蛹虫草均引起小鼠空肠组织TLR4表达量显著降低(P<0.05),NF-κB表达量的降低程度与蛹虫草灌胃剂量呈正相关。蛹虫草能够提前恢复环磷酰胺导致的脏器损伤,显著提高免疫抑制小鼠IgM、IgG和IL-2水平(P<0.05),促进外周血CD3^(+)CD4^(+)和CD3^(+)CD8^(+)T淋巴细胞亚群的增殖。综上,短期服用蛹虫草可以降低肠道炎症的发生风险,不会引起正常免疫状态的失衡;蛹虫草可以通过增强体液免疫和细胞免疫促进机体免疫抑制状态的恢复,可用于免疫调节剂的开发和利用。

响应面法优化蛹虫草下饭菜工艺及挥发性物质分析

以杏鲍菇和蛹虫草为主要原料,研发一种蛹虫草下饭菜,以感官评分为指标,利用单因素试验、正交试验和响应面试验获得制作蛹虫草下饭菜的最佳工艺条件,最终确定配方为杏鲍菇添加量35%、蛹虫草添加量10%、香菜碎添加量7.5%、辣椒粉添加量1%。此外,对最佳配方产品进行理化分析和挥发性风味物质鉴定,得出最佳工艺条件下蛹虫草下饭菜的水分含量为25.83%,脂肪含量为39.69%,蛋白质含量为4.92%,水分活度为0.8817。共检测出43种挥发性风味物质,包括醇类、醛类、酸类、酮类、醚类、烯烃类以及其他类风味化合物。该研究为蛹虫草相关产品的开发与研制提供了一定的理论基础。

铬元素在蛹虫草中的富集及机理

以新资源食品蛹虫草作为富集载体,在培养基中添加不同浓度的铬元素,探究蛹虫草的耐铬能力和富铬作用,研究铬元素对蛹虫草产量和品质的影响,并基于转录组学分析蛹虫草富铬的作用机制。结果表明,当铬元素添加浓度为400µg/mL时,蛹虫草菌丝生物量或菌落直径达到最大值,蛹虫草菌丝富铬率也最高;子实体直径、高度和生物转化率均达到最大值;添加较高浓度的铬元素后,污染率明显提高,子实体甚至发生畸变,说明过高浓度的铬元素对蛹虫草子实体的生长具有一定的胁迫作用。以普通蛹虫草和富铬蛹虫草为材料,对比分析筛选出796个差异表达基因,差异表达基因主要富集在核糖体、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、甲烷代谢和氨基酸生物合成5条代谢通路上。

蛹虫草对帕金森病干预机制的研究进展

帕金森病(PD)是以中老年人群神经系统退行性病变为主的一种发病率极高的疾病。蛹虫草是东南亚传统的食药两用真菌,本文系统总结了蛹虫草在PD中神经保护作用的最新进展,重点归纳了其在多巴胺调节、抗细胞凋亡、抗氧化、抗炎、抗内质网应激和调节线粒体功能障碍方面的分子机制。强调了蛹虫草对PD治疗作用,以期为深入研究安全有效的天然PD替代药物提供参考。

响应面法优化柞蚕蛹虫草活性肽提取工艺研究

为优化柞蚕蛹虫草多肽提取工艺,本试验分别研究了pH、酶解时间、反应温度和加酶量对多肽得率的影响,并采用响应面法对提取条件进行了优化。结果表明:四种因素对柞蚕蛹虫草多肽得率的影响顺序为pH>酶解时间>反应温度>加酶量,最佳酶解条件为:酶解时间2.8 h、加酶量2%、pH 9.7、反应温度56℃。在此酶解条件下进行验证试验,测得柞蚕蛹虫草多肽得率平均值为86.1%,与预测值87.52%接近,表明该模型能较好地预测辅助提取柞蚕蛹虫草活性肽,可为柞蚕蛹虫草的产业性开发应用提供依据。

北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的机制研究

为了检测北虫草多糖对巨噬细胞极化状态的影响,研究采用外源北虫草多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7后,检测巨噬细胞极化状态的变化,探究北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的分子机制。结果表明,北虫草多糖刺激可以促进培养巨噬细胞的M1型极化,且极化过程活化了参与炎症免疫应答的NF-κB通路,这一结果初步揭示了北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的机制,为进一步深入理解北虫草多糖调控机体免疫力提供理论依据。

北虫草液体菌种培养基优化及胞外多糖抗氧化性初探

针对北虫草人工栽培中菌丝液体发酵培养菌丝长速慢,产量不高的问题。研究引入了用于人工栽培的北虫草菌种(Cordyceps militaris),对其液体发酵培养基进行了优化并提取北虫草胞外多糖测定其抗氧化活性。结果表明,单因素筛选实验及Plackett-Burman分析表明最佳碳源、氮源、无机盐分别为蔗糖、酵母粉、磷酸二氢钾。爬坡试验进一步得出,当蔗糖浓度为25 g·L^(-1)、酵母粉为6 g·L^(-1)、磷酸二氢钾为2 g·L^(-1)时,北虫草生物量达到较大值2.113 g·L^(-1)。最后经中心组合试验设计和响应面法分析得出,最佳培养基配方为:蔗糖26.364 g·L^(-1)、酵母粉6.699 g·L^(-1)、磷酸二氢钾2.093 g·L^(-1),此时菌丝干重达到最大值为2.314 g·L^(-1)。验证实验表明结果准确,产量提升了107.34%。对胞外多糖提取物的DPPH自由基及ABTS自由基清除率,超氧阴离子自由基与脂质过氧化抑制率测定试验表明清除率与样品浓度呈正相关。

蛹虫草有效成分提取及活性分析

以蛹虫草为原料,探究其活性成分的提取方法及优化,并探讨蛹虫草提取液(Cordyceps militaris extract,CME)在护肤品中的应用。结果表明:CME在提取温度80℃、水(mL)料(g)比40∶1、提取次数3次、提取时间75 min条件下提取率最高,为7.51%,且影响CME提取率的因素顺序为提取温度>水料比>提取次数>提取时间;当质量浓度为0.06~1.92 g/L时,CME的清除自由基及还原能力随其质量浓度增加呈上升趋势;当质量浓度为1.92 g/L时,CME的羟自由基的清除率为65.04%,DPPH自由基的清除率为53.30%,ABTS自由基的清除率为19.98%,铁离子还原能力达2 575.75μmol/L,表现出良好的抗氧化性,而且CME的保湿效果仅略低于甘油。研究为进一步拓展蛹虫草提取物在护肤品领域的应用奠定基础,为中药草本护肤品的研发和应用提供参考。

不同包装和贮藏条件对蛹虫草品质的影响

为了探索和研究蛹虫草保鲜的包装和贮藏条件,采用托盘保鲜膜包装、PE密封包装、PE真空包装、透气保鲜盒包装和黑色塑料袋包装处理新鲜蛹虫草子实体,分析不同贮藏条件下蛹虫草的品质变化及贮藏期。结果表明,蛹虫草在4℃条件下的贮藏效果优于室温;室温条件下透气保鲜盒和托盘保鲜膜效果良好,在4℃条件下PE密封包装效果最好。

PEG介导的广东虫草原生质体遗传转化体系建立及其应用

【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝体为材料,采用单因素分析方法对原生质体制备过程中酶解组合、酶解时间、酶解温度、复苏培养基及抗性标记进行筛选。同时以潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300为转化片段,采用单因素分析方法对PEG介导的原生质体转化过程中亚精胺浓度、PEG加入间隔时间、抗生素添加时间进行筛选。并以广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子CgPro1敲除片段为目的转化片段,对转化系统进行验证。【结果】广东虫草原生质体制备的最佳组合条件为:采用含有裂解酶+崩溃酶的混合酶体系(1∶1)对广东虫草的菌丝体进行酶解,且酶解温度28℃、酶解时间为5.5 h时原生质体得率最高;原生质体复苏过程中,TB3复苏培养基对广东虫草原生质体的复苏效果最好、其次为0.6mol/L KCl-PDA;PEG介导原生质体转化过程中,加入5 mmol/L亚精胺、PEG加入间隔时间10 min、原生质体复苏3 d后添加250μg/mL潮霉素抗性标记进行筛选,转化效率最高。此外,通过建立的转化系统获得3个CgPro1敲除突变株及3个杂合子,表型分析结果显示,该基因参与广东虫草子实体发育过程。【结论】建立了成熟的广东虫草原生质体制备及PEG介导的遗传转化体系,可为今后广东虫草基因功能、蛋白定位等遗传操作研究奠定良好基础,同时为广东虫草遗传育种提供重要应用参考。

蛹虫草茯茶的加工工艺及其代谢产物特征分析

为明确蛹虫草茯茶的加工工艺关键步骤及其代谢产物特征,研究分析了汽蒸时间及原料配比对蛹虫草茯茶品质的影响,进而利用液相色谱-质谱联用法对蛹虫草茯茶的代谢产物进行了全面解析.结果表明:8%蛹虫草与黑毛茶复配,汽蒸10 min制备的蛹虫草茯茶茶多酚含量为47.84±2.33 mg/g,显著低于传统茯茶;蛋白质含量达到233.89±4.30 mg/g,显著高于传统茯茶.代谢组分析结果显示,与茯茶相比,蛹虫草茯茶有119种代谢物显著发生变化(VIP>2.0,p<0.05),其中72种代谢产物相对含量显著增加,47种代谢产物相对含量显著下降.其中,氨基酸类代谢物占比最多,且上调数量明显高于下调数量.代谢通路分析证实,蛹虫草茯茶与茯茶的差异代谢物主要是通过精氨酸和脯氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、烟酸和烟酰胺的代谢及精氨酸生物合成等代谢途径产生.本研究初步探索了蛹虫草茯茶的加工工艺关键步骤,并揭示了蛹虫草茯茶的代谢产物特征.为促进茯茶产品多元化以及深入开发蛹虫草茯茶功能奠定物质理论基础.

两种方法制备的蛹虫草小分子肽分子量分布及体外抗氧化能力对比研究

目的探究复合酶解法与酶-高压蒸煮耦合水解法制备蛹虫草小分子肽的分子量分布情况与体外抗氧化活性差异。方法采用凝胶色谱法检测两组肽分子量分布情况,并分别测定总抗氧化能力(T-AOC),羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力,综合评价两组多肽体外抗氧化能力。结果两种方法制备的肽样品分子量分布情况相近,分子量<10×10^(3) Da的组分占比近60%,分子量<5×10^(3) Da的组分占比约31%。两种方法制得的分子量<10×10^(3) Da、分子量<5×10^(3) Da的蛹虫草活性肽的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基能力均优于还原性谷胱甘肽(GSH)。其中复合酶解法所得分子量<5×10^(3)活性多肽的T-AOC活性明显高于GSH。结论两种方法制备的多肽分子量分布无明显差异,且均具有良好的体外抗氧化活性。