虾夷扇贝毒素yessotoxins(YTXs),中国沿海贝类中首次发现的一组贝类生物毒素

采用高效液相色谱-串联质谱方法对我国近海贝类中腹泻性贝毒成分进行研究,结果发现采自北黄海大连附近海域的海湾扇贝和虾夷扇贝含有25~41μg/kg的虾夷扇贝毒素（yessotoxin,YTX）,在虾夷扇贝体内还含有37.2μg/kg的45-OH-YTX,并在5种贝中发现微量的Homo-YTX毒素组分,这是首次报道在我国贝中检出此类毒素。虾夷扇贝毒素YTXs是一类含有2个磺酰基的脂溶性多环聚醚类化合物,对小鼠的腹腔注射急性致死毒性很高,毒理作用机制尚不清楚。本研究的结果说明我国贝类体内生物毒素成分复杂,亟需进行毒素成分结构、来源生物、生态毒理效应、分布规律及安全限定标准的研究。

液相色谱-串联质谱法同时测定贝类中大田软海绵酸、鳍藻毒素、蛤毒素和虾夷扇贝毒素

建立了同时测定贝类中大田软海绵酸(okadaic acid,OA)及其衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxin-1,DTX-1)、蛤毒素(pectenotoxin-2,PTX-2)和虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX)的液相色谱-串联质谱分析方法。样品经甲醇提取,固相萃取柱净化,C18色谱柱分离,经含甲酸和甲酸铵的乙腈-水溶液为流动相梯度洗脱,选择反应监测(SRM)模式检测,正、负离子切换扫描,基质标准校正,外标法定量。结果表明,OA、DTX-1和YTX的线性范围为2.0～200.0μg/L,定量限(以信噪比(S/N)≥10计)为1.0μg/kg;PTX-2的线性范围为1.0～100.0μg/L,定量限为0.5μg/kg;几种化合物的添加平均回收率为83.1%～105.7%,相对标准偏差(RSD)为3.16%～9.29%。成功应用本法对黄海灵山湾海域采集的贝类样品进行了分析,发现部分样品中含有大田软海绵酸、鳍藻毒素、蛤毒素和虾夷扇贝毒素。

虾夷扇贝毒素对ICR小鼠小脑浦肯野细胞毒性作用的初步研究

以雌性ICR小鼠为研究对象,尾静脉注射虾夷扇贝毒素24h后处死,通过脑组织切片,苏木精伊红染色、甲苯胺蓝染色以及钙结合蛋白S-100免疫染色,研究了虾夷扇贝毒素对小鼠浦肯野细胞的毒性作用。结果表明,尾静脉注射虾夷扇贝毒素的小鼠小脑浦肯野细胞细胞质有明显变化,同时在光学显微镜下观察到细胞核有收缩而用钙离子结合蛋白S-100的免疫荧光染色结果表明,虾夷扇贝毒素作用后,小鼠浦肯野细胞的S-100蛋白表达增多,而其他组织则没有明显变化。浦肯野细胞形态学以及细胞内钙离子结合蛋白的变化说明虾夷扇贝毒素可能对神经细胞有毒性作用。

虾夷扇贝毒素对Hela细胞凋亡的诱导及胞内钙离子浓度的影响

通过MTT分析、光学显微镜观察、Hoechst33342染色质荧光染色、DNA琼脂糖凝胶电泳、罗丹明123染色及钙离子激光扫描显微镜检测等手段,分析了虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX)对Hela细胞的毒性作用。通过实验发现,正常Hela细胞与不同浓度YTX共孵育24 h后,一定浓度的YTX能对Hela细胞产生毒性作用,使其发生明显凋亡特征,如形态变化、染色质凝缩、DNA片段化以及线粒体膜电位降低。此外,YTX还能造成Hela细胞内胞质钙离子升高。这种毒性作用可能是YTX通过对胞内钙离子浓度的影响进而诱导发生的。

虾夷扇贝毒素对Hela细胞凋亡诱导作用的初步研究

以Hela细胞为研究对象,通过四氮唑蓝(MTT)比色法、光学显微镜观察、Giemsa染色以及DNA凝胶电泳,研究了几种产YTXs的赤潮藻种多边舌甲藻(Lingulodinium polyedrum)CCMP1931,具刺膝沟藻(Gonyaulax spinifera)CCMP409,网状原角藻(Protoceratium reticulatum)CCMP2776粗提液对细胞的凋亡诱导作用,并通过LC-MS/MS分析各粗提液的成分及毒性大小。结果表明:CCMP1931、CCMP409、CCMP2776均对Hela细胞有毒性作用,能引起细胞凋亡事件,同时,分析其毒素成分发现,3种藻均能产生YTX及其衍生物,且相对毒力大小为CCMP2776>CCMP1931>CC-MP409。

虾夷扇贝毒素(yessotoxin)诱导的栉孔扇贝(Chlamys farreri)体内P糖蛋白转运活性及其分布研究

大量研究表明P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导的多型异源物质抗性机制(multi-xentiobiotic resistance,MXR)在贝类耐受或抵抗污染水域中有毒有害物质的毒害中具有重要作用,但是该机制在贝类抵抗或耐受食源性毒素方面作用的研究却很少。本研究以栉孔扇贝(Chlamys farreri)为实验动物,向其投喂产虾夷扇贝毒素(yessotoxins,YTXs)的网状原角藻(Protoceratium reticulatum),通过检测栉孔扇贝鳃和消化腺组织中YTX毒素含量随时间的变化情况,结合2种组织中P-gp介导的MXR活性变化及P-gp在组织中的表达和分布,探讨P-gp在扇贝耐受YTX毒素中可能的作用。研究结果表明,随着毒藻暴露时间的延长,栉孔扇贝鳃和消化腺中YTX含量逐渐增加,且具有明显的时间依赖关系。YTX的大量累积虽未导致扇贝死亡,但是仍然对扇贝组织产生不同程度的毒性。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色发现,染毒12 h后,栉孔扇贝鳃组织前端出现明显黑化,消化腺组织导管上皮细胞部分脱落入管腔中,腺管内细胞界限模糊,部分腺管崩解。罗丹明B(rhodamine B,Rho B)外排实验表明YTX毒素暴露能显著增强栉孔扇贝鳃和消化腺组织中P-gp的转运活性,暴露12 h后鳃和消化腺Rho B的排出速率就已分别达到对照组的3.8倍和1.4倍,随着暴露时间的延长,P-gp活性略有增强,72 h后开始下降;P-gp的功能性抑制剂维拉帕米(verapamil,VRP)在实验设定的浓度下没有抑制反而增强了Rho B的外排;免疫定位显示,毒素暴露后栉孔扇贝鳃丝前端纤毛柱状细胞及消化腺导管上皮柱状细胞和腺管消化细胞P-gp免疫阳性信号增强,说明YTX毒素暴露提高了P-gp的表达量。综上推断,YTX毒素可能是P-gp的底物,它能够诱导P-gp转运活性增强,并增加P-gp的表达量来参与扇贝对YTX毒素的耐受或抗性;设定浓度的VRP不能抑制P-gp的活性,这可能是由于种属差异造成的,关于VRP对栉孔扇贝Pgp的作用还有待进一步的研究。

液相色谱-高分辨质谱测定贝类中虾夷扇贝毒素

[目的]建立贝类产品中虾夷扇贝毒素(YTX)的液相色谱-四极杆-静电轨道场离子阱高分辨质谱检测方法。[方法]以牡蛎和文蛤为研究对象,样品经甲醇提取,采用QuEChERS净化,经Hypersil GOLD C 18色谱柱分离,乙腈和0.002 mol/L甲酸铵溶液(含0.2%甲酸)为流动相梯度洗脱,负离子全扫描+数据依赖二级扫描,提取一级谱图中准分子离子精确质量数定量,二级质谱图中特征离子精确质量数定性。[结果]虾夷扇贝毒素(YTX)在12 min内出峰,定量限为0.3μg/kg,在9.05~181.00μg/L范围内线性良好,相关系数r=0.9964,回收率96.3%~102.8%,相对标准偏差(RSD)小于14.2%(n=6)。[结论]该研究为贝类毒素监控提供了技术支持。

我国虾夷扇贝毒素的研究进展

虾夷扇贝毒素(yessotoxins,YTXs)是甲藻产生,并可在滤食性生物体内累积的一类多环聚醚海洋微藻毒素。由于其经常与腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)中的大田软海绵酸(okadaic acid,OA)和鳍藻毒素(dinophysistoxins,DTXs)共同存在,所以YTXs最初被划分为腹泻性贝毒。研究表明YTXs并不会诱导腹泻,也不具有抑制蛋白磷酸酶2A活性的能力,而是对动物的心脏、肝脏、神经系统造成损伤,所以研究人员将其从DSP组中分离出来。随着对YTXs的分子生物学研究不断深入,科研工作者已从贝类和甲藻中分离出100多种YTX同系物,其中仅有约40种衍生物的结构通过高效液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)和核磁共振技术(NMR)得到证实。YTXs毒素广泛分布于全球海域,其潜在威胁不容忽视。本文对虾夷扇贝毒素的来源、分布、毒性以及国内研究现状等进行了综述,以期为深入研究、制定监测规划、预防和消除其危害提供理论基础。

网状原角藻中虾夷扇贝毒素提取与纯化

通过批量培养可产生虾夷扇贝毒素的网状原角藻,对获得的藻泥细胞超声破碎后,用甲醇提取;用大孔吸附树脂(HP20)吸附网状原角藻分泌于培养液中的胞外毒素,用70%的乙醇洗脱吸附于树脂上的毒素。采用高效液相色谱-串联质谱法,在网状原角藻毒素提取液中,发现9种虾夷扇贝毒素及其类似物,其中虾夷扇贝毒素YTX占总量95.1%,41YTX占3.65%,其他类似物共占1.25%。采用高效制备液相色谱分离纯化5次,获得的虾夷扇贝毒素经高分辨质谱法确认其分子量为1142.4747,分子式为C_(55)H_(82)O_(21)S_(2),定量核磁法检测其纯度超过99%,满足虾夷扇贝毒素标准物质制备要求。

海洋脂溶性藻毒素虾夷扇贝毒素产毒来源、毒性效应和检测技术研究进展

海洋藻毒素是由海洋有毒微藻分泌产生的有毒物质,可通过食物链传递,导致养殖海产品染毒或者死亡,对人类消费者的健康造成威胁。近年来有毒赤潮频发,海洋藻毒素对海产品的食用安全影响备受关注。虾夷扇贝毒素是一种脂溶性的藻毒素,在世界范围内广有分布。近年来,随着分析化学检测技术被逐渐应用于我国海产品的藻毒素检测和质量监控,虾夷扇贝毒素在我国近海多个海域的贝类样品中被检测出来,但是我国对于该类毒素的毒性作用研究相对较少。本文综述了虾夷扇贝毒素的生物来源、地理分布、化学结构、毒性作用机制及检测方法的研究进展,结合我国国内的调查研究现状,为海洋生态环境监控提出新的建议,即目前除了对常规浮游植物类群进行监控以外,还应加强有毒甲藻孢囊多样性监测,同时,基于虾夷扇贝毒素的毒性作用机制,为海洋药物活性开发和利用提供了新思路。

虾夷扇贝毒素组的危害评估

虾夷扇贝毒素组(YTXs)是一类多环聚醚类化合物,是8大贝类毒素之一。在世界各地广泛分布,对人体的潜在危害不容小觑。但是目前人们对YTXs的毒性、毒代动力学和致病机制等了解不多,同时我国对YTXs的管理也处于空白阶段,尚未制定相关的贝类肉类中限值和急性毒性参考剂量等指标。为增进对该类毒素的了解和推进其风险评估工作,本文从虾夷扇贝毒素的理化性质和来源、毒代动力学和毒性、国内外的管理现状和危害特征描述等进行了综述,并提出了未来需要重点关注和解决的问题。

液相色谱结合串联质谱方法研究中国沿海贝类中脂溶性藻毒素的种类结构和分布规律

一些海洋微藻能分泌产生藻毒素,滤食性的双壳贝类食用有毒的浮游微藻并在体内累积藻毒素,进而引发贝类食用者或其它高等级动物中毒或死亡。脂溶性藻毒素是一些易溶于有机溶剂、因而易富集于动物脂肪组织中的微藻毒素,通常包含6大类,每种类均包括众多结构。使用高效液相色谱结合串联质谱(HPLC-MS/MS)技术方法,研究了来自中国沿海55个站位的34种贝类中脂溶性藻毒素的种类结构及分布。结果表明,在中国沿海多种双壳贝类体内,存在多种脂溶性藻毒素组份,包括软海绵酸毒素OA(Okadaic acid)、扇贝毒素PTXs(Pectenotoxin)、原多甲藻酸Azaspiracid(AZAs)毒素、虾夷扇贝毒素YTXs(Yesssotoxin)、环亚胺类毒素(Cyclic imines)中的Gymnodimine(GYM)和Spiroloides(SPX)毒素;其中南部海域的广东、广西和海南,主要以环亚胺类毒素GYM为主;北黄海主要以虾夷扇贝毒素YTXs为主,且虾夷扇贝毒素YTXs只在黄海海域检出,特别是主要存在于北黄海的虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)中;渤海沿岸,主要分布有扇贝毒素PTXs;扇贝毒素PTXs和虾夷扇贝毒素YTXs含量和检出频率都比较高;扇贝毒素共发现三种结构,其中酸式结构PTX-2Sa的检出率最高(44%),最高值为53.2μg·kg-1;其次是环亚胺类毒素中的GYM毒素,检出率为35.3%,最高值为39.1μg·kg-1;虾夷扇贝毒素YTXs共发现三种结构,北黄海浮筏养殖虾夷扇贝中的虾夷扇贝毒素YTXs总量最高值出现在秋季的9月份;中国北黄海虾夷扇贝中YTXs毒素长年存在,秋季含量较高。微藻毒素的分布取决于产毒微藻的分布,目前中国贝类中的这三种主要微藻毒素的生物学来源还尚未确定。简言之,中国海产贝类中存在扇贝毒素PTXs、虾夷扇贝毒素YTXs和环亚胺类毒素等多种脂溶性微藻毒素,尽管本次研究的含量水平还没有超过国际规定的食用安全阈值,但海产贝类藻毒素食用安全不容乐观,相关部门需加强监管,加大力度实施贝毒和有毒微藻监测计划,以保障中国水产养殖经济的可持续发展和人们健康。

温度和营养盐限制对网状原角藻生长与产毒的影响

网状原角藻(Protoceratium reticulatum)是能够形成有毒赤潮的海洋甲藻之一,所产毒素为虾夷扇贝毒素(yessotoxins,YTXs),该藻在全球很多海域中普遍存在,其生长与产毒特征表现出较强的海域差异性。以分离自我国北黄海海域的网状原角藻为实验对象,研究了温度和营养盐(N、P)限制对该藻生长与产毒的影响。研究发现:温度和营养盐限制对藻细胞的生长和产毒均有影响,但营养盐限制影响更为显著。较低的温度更适宜P.reticulatum的生长,15℃时无营养盐限制的L1-Si培养基中藻细胞生长最好。营养盐限制尤其是P限制能够显著降低藻细胞的比生长速率和细胞密度(P<0.01),缩短藻细胞指数生长期和稳定期的持续时间。所有温度下N、P限制均有利于藻细胞内毒素累积,15℃P限制培养基中单个藻细胞中YTX毒素最高,达到92.6 pg/细胞,分别是相同培养温度下N限制和L1-Si中藻细胞毒素含量的3.8倍和7.1倍。温度变化对N和P限制下藻细胞毒素含量影响不同:在5—15℃范围内,随温度升高,N限制培养基中藻细胞YTX含量增幅逐渐下降,而P限制条件下反之。在所有培养条件下,滤液中毒素含量在稳定期后开始增多,与L1-Si相比,N、P限制不利于毒素的释放。高温能促进L1-Si培养基和N限制培养基中毒素的释放,但对P限制影响不显著。

春季中国沿海主要养殖贝类中脂溶性贝毒的组分分析和地域特征

海洋滤食性双壳贝类通过摄食产毒微藻,在体内积累藻毒素并经代谢转化形成化学结构多样的贝类毒素,潜在威胁消费者的身体健康甚至生命。为了解中国贝类海产品沾染脂溶性贝毒的情况,于2016年春季在中国沿海10个城市采集31种养殖贝类(68份样品),并采用LC-MS/MS方法对10种脂溶性贝毒进行同步检测。结果显示,中国沿海养殖贝类遭受多种脂溶性贝毒污染,其中包括环亚胺毒素(gymnodimine-A,GYM-A)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX)、蛤毒素(pectenotoxin-2,PTX-2)和螺环内酯毒素(spirolide-1,SPX-1),毒素含量分别为0.85~211.47、4.51~54.64、0.55~6.16和0.19~2.35μg/kg,毒素检出率依次为26.5%、10.3%、13.2%和14.7%。毒素的总体分布趋势显示,GYM-A和SPX-1毒素在中国南部海域的污染程度相对较重,且分布范围已扩散至东海和黄海;YTX毒素则主要分布于渤海、北黄海海域;PTX-2广泛分布于渤海、黄海、东海和南海四大海域。该调查结果表明,中国贝类海产品食用安全的风险不容忽视。

网状原角藻在种间相互作用下的生长及产毒变化研究

虾夷扇贝毒素(Yessotoxins,YTXs)是近十年来在我国沿海城市贝类样品中检测出的海洋赤潮毒素物质,能危害人类健康。本研究选取产YTXs的网状原角藻(Protoceratiumreticulatum)作为研究对象,通过不同方式将其与常见赤潮硅藻——拟旋链角毛藻(Chaetocerospseudocurvisetus)混合培养,对比单独培养条件下网状原角藻的细胞比生长率、体积比生长率、所产毒素组成以及单细胞毒素含量等指标,研究种间作用对网状原角藻生长和产毒的影响。结果表明,直接培养条件下,不同接种密度,拟旋链角毛藻的生长都会被网状原角藻不同程度的抑制,而间接接触培养条件下,网状原角藻的生长受培养环境的影响较大,因此在其生长、运动空间严重受限制的条件下,其生长反而被拟旋链角毛藻抑制。在各混合培养体系中,网状原角藻的体积变化并不显著,其分泌的YTX毒素组分差异也不明显,可见该藻并不是通过体积增大或者毒素分泌增加来提高其竞争优势的。本研究对于探索赤潮发生原因,加强赤潮预警具有重要意义。