虾十足目虹彩病毒1、肝肠胞虫及传染性早熟病毒多重Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测十足目虹彩病毒1(DIV1)、肝肠胞虫(EHP)、传染性早熟病毒(IPV)的多重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据DIV1 MCP基因、EHP SSU基因与IPV polyprotein A基因设计特异性引物和Taq Man探针,经各反应条件的优化建立了同时检测DIV1、EHP及IPV的多重Taq Man荧光定量PCR方法。利用该方法检测DIV1、EHP、IPV、白斑综合征病毒、致急性肝胰腺坏死弧菌、传染性皮下及造血器官坏死病毒、虾偷死病毒、传染性肌肉坏死病毒、桃拉病毒、黄头病毒1型等主要虾类病毒,结果显示,该方法仅能扩增出DIV1、EHP和IPV,与其他主要虾类病原均无交叉反应,特异性较强。对10倍倍比稀释后等浓度等体积混合的DIV1、EHP和IPV质粒标准品混合物的检测结果显示,该方法对3种病原的质粒标准品的检测限均为1.67×10^(1)拷贝/μL,各病毒单一荧光定量PCR方法的检测限均为1.67×10~0拷贝/μL,多重Taq Man荧光定量PCR方法的灵敏度虽略低于单一荧光定量PCR方法,但是可以同时检测3种病原,检测效率高。选取3个浓度的pDIV1、pEHP、pIPV(5×10^(5)拷贝/μL、5×10^(4)拷贝/μL、5×10^(3)拷贝/μL)等浓度等体积混合的质粒标准品为模板,进行组内和组间重复性试验,结果显示组内与组间重复性试验的变异系数均小于1%,该方法重复性较好。利用该方法与DIV1、EHP、IPV单一荧光定量PCR方法同时检测105份虾苗和亲虾样品,结果显示,本研究建立的多重Taq Man荧光定量PCR方法对DIV1的检出率为21.9%(23/105),对EHP的检出率为14.3%(15/105),对IPV的检出率为45.7%(48/105),3种病原混合感染率为1.9%(2/105),与DIV1、EHP、IPV各单一荧光定量PCR方法的检测结果均一致,阳性样品的符合率达100%。本研究建立的DIV1、EHP、IPV多重Taq Man荧光定量PCR方法为临床同时检测该3种病原提供了特异、敏感、高效的技术手段。

一例罗氏沼虾虹彩病毒病治疗案例

一、基本情况2023年5月初,浙江省嘉兴市罗氏沼虾养殖户陆续发现养殖虾出现异常情况。初期摄食减少、虾趴边漫游、反应迟钝,约3天左右,额刺基部甲壳内会出现白点,中后期病虾表现为身体微红、鳃发红、肝胰腺发红、空肠空胃等症状,并大量死亡。有养殖户将病虾送检,经套式PCR检测为阳性,确认此病为虹彩病毒病。至6月初后,高邮市大面积爆发此病。直至7月中旬水温上升,罗氏沼虾虹彩病毒病逐渐停止。后经初略估计,该地区发病率可能达到90%以上。许多养殖户因无法控制因此病引起的养殖沼虾死亡,只能卖虾清塘。

虹彩病毒致死率超60%!养殖业的噩梦能否终结?三仪全新技术带来突破性解决方案

近年来,水产养殖业进入了前所未有的寒冬期。除了市场行情低迷,更令人担忧的是病害频发,养殖风险不断加大。例如,罗氏沼虾、鳜鱼、加州鲈等品种深受虹彩病毒的重创,其发病快、传染性强,死亡率高达60%以上,给养殖业造成巨大经济损失,令众多养殖户谈之色变。

罗氏沼虾虹彩病毒病防控措施

2022年扬州高邮、江都等地区5月开始发生罗氏沼虾虹彩病毒病,其中江都地区6月初发病面积达3000亩、高邮地区发病面积达30%,与2021年相比呈上升趋势,从5月到6月底一直持续发病,但随着水温的上升,发病率及传播速度明显降低,原有发病较重的池塘病虾死亡量不再升高,部分池塘发病逐渐减轻;9月初随着水温下降,虹彩病毒病又开始暴发,很多养殖户由于未及时捕捞上市从而造成巨大经济损失。

罗氏沼虾虹彩病毒病防治要点

江苏省是我国罗氏沼虾主要养殖区域之一,随着罗氏沼虾养殖密度增加,病害时有发生,尤其是近年来暴发的虹彩病毒病。该病毒具有传播速率快、宿主范围广、致死率高等特点,给罗氏沼虾产业造成了较大的经济损失。通过流行病学调查发现,水温为25~32℃时易暴发虹彩病毒病,在低于24℃或高于34℃时。

罗氏沼虾十足目虹彩病毒病流行病学调查及预防控制试验

为探索罗氏沼虾十足目虹彩病毒病预防控制技术,笔者开展了其流行病学调查,并采用罗氏沼虾池塘套放鮰鱼预防十足目虹彩病毒病,取得了较好的效果。现将调查和试验情况报告如下。一、十足目虹彩病毒病流行病学调查扬州市罗氏沼虾十足目虹彩病毒病于2021年首次发现,此病从池塘发现数只病虾至发病高峰仅2~3周。

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒和虾虹彩病毒检测及分析

2020年检测安徽省滁州、安庆和合肥的20个稻田养殖的200只克氏原螯虾(Procambarus clarkii)鳃组织中白斑综合征病毒和虾虹彩病毒,结果发现白斑综合征病毒阳性检出率为97.5%,病毒含量达106拷贝/mg的检出率与克氏原螯虾死亡率呈正相关。虾虹彩病毒阳性检出率为13%,只在滁州的3个和合肥的2个稻田的养殖虾中检出。

红螯螯虾虹彩病毒在两种螃蟹内的研究

最近报道从患病的红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)中分离出一种新的虹彩病毒,被暂时命名为红螯螯虾虹彩病毒.它还能感染克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),为了探究红螯螯虾虹彩病毒是否能够感染同属于甲壳纲、十足目的螃蟹.选取中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)和粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)作为实验对象,应用实时荧光定量PCR技术和透射电子显微镜技术,结论证明了红螯螯虾虹彩病毒能够感染中华绒鳌蟹和粗腿厚纹蟹.推测其他蟹类也可能是其潜在的宿主,这暗示着红螯螯虾虹彩病毒对螃蟹的养殖是一种潜在的威胁.

虾虹彩病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测虾虹彩病毒(SIV)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,为实现虾虹彩病毒病(SIVD)快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段。【方法】根据SIV的MCP基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的片段克隆至pMD18-T载体制备重组质粒pMD18-T-MCPSIV;优化反应体系及扩增条件后建立检测SIV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,以pMD18-T-MCPSIV为标准品绘制标准曲线,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性。【结果】制备的重组质粒(pMD18-T-MCPSIV)DNA稳定性好,满足作为标准品的要求;标准品起始模板范围为2.0×101~2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR灵敏度高,对重组质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对虾组织SIV的检测灵敏度约10拷贝/mg,其临床检测的敏感性与套式PCR相当;与虾类其他常见病原无交叉反应,组内和组间变异系数分别为0.27%~0.54%和0.61%~0.95%,且扩增与产物分析同步完成,整个检测过程仅需1 h左右。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床虾样品进行SIV检测,结果显示,两种方法的大部分检测结果一致,符合率为98.6%,但检测低拷贝数样品时前者具有更高的灵敏度。2018和2019年广西虾样品的SIV阳性检出率分别为19.7%和7.5%,且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾和红螯螯虾均检测到SIV阳性。【结论】基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品SIV检测,可为SIVD快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段。

罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病(WTD)及虹彩病毒病(DIV1D)的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段分别克隆至pGM-T载体上制备重组质粒(pGM-T-CP^(MrNV)和pGM-T-MCP^(DIV1)),其中,pGM-T-CP^(MrNV)用Sal I酶切后经体外转录获得MrNV标准品RNA,pGM-T-MCP^(DIV1)则直接作为DIV1标准品DNA;以标准品为模板进行反应条件优化及标准曲线制定,建立可同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很好的稳定性,可作为标准品和阳性对照使用;标准品起始模板范围为1.0×10^(1)~1.0×10^(8)Copies/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的二重荧光定量PCR灵敏度高,对标准品的检测灵敏度可达10 Copies/反应,对罗氏沼虾组织样品的检测灵敏度约10 Copies/mg;与其他虾类常见病原无交叉反应,且整个检测过程仅需1 h左右。二重荧光定量PCR检测MrNV的组内试验和组间试验变异系数分别为0.31%~0.93%和0.96%~1.33%,检测DIV1的组内试验和组间试验变异系数分别为0.35%~0.81%和0.78%~1.04%。应用建立的二重荧光定量PCR和国内现行有效标准的套式PCR分别对117份临床样品进行MrNV和DIV1检测,结果显示对MrNV和DIV1检测的符合率分别为99.15%和97.44%,且二重荧光定量PCR检测目标病毒拷贝数较低样品时较套式PCR具有更高的灵敏度。2020年广西罗氏沼虾样品MrNV和DIV1的阳性检出率分别为6.0%和11.0%。【结论】结合TaqMan-MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1,且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点,可为WTD和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障。

虾血细胞虹彩病毒在青虾中的感染情况调查分析

本研究对浙江省湖州市德清县的青虾养殖塘进行虾血细胞虹彩病毒(SHIV)的监测工作。2020年7—10月分别在2个青虾养殖户中检出感染SHIV的青虾,2021年在对德清县6个乡镇共计12个监测点中发现,50%养殖户的青虾有感染SHIV的情况。对SHIV阳性的青虾肝胰腺进行组织病理学染色分析表明,肝胰腺组织中存在核固缩的现象,同时透射电镜可以观察到疑似SHIV病毒粒子的结构。本研究初步探究了SHIV在日本沼虾中的流行情况,为SHIV与青虾病害的相关性提供了研究基础。

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1,DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25μl反应体系中包含2.5μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg^2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart■DNA聚合酶、0.8μmol/L EvaGreen■和4.4μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×10^2拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder■替换EvaGreen■并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。

苏北地区凡纳滨对虾3种主要病毒的分离及快速鉴定

从连云港和盐城等地收集了来自不同对虾养殖池塘的587个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)样本,采用基因芯片快速检测技术对样本白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和虾血虹彩病毒(shrimp henocyte iridescent virus,SHIV)等3种病原体进行分离与快速鉴定。共检测出18个阳性样本,其中13个样本WSSV呈阳性,4个样本IHHNV呈阳性,1个样本SHIV呈阳性;阳性样本占样本总数的3.07%,且阳性样本中WSSV又占了阳性样本总数的72.22%。对这些病原的快速鉴定,可为病害诊断、预警预报、科学防控等提供依据,从而减少暴发性病毒病给对虾养殖带来的经济损失。

2022年宁波市南美白对虾主要病原流行病学调查

为了解虾肝肠胞虫(EHP)、十足目虹彩病毒1(DIV1)、白斑综合征病毒(WSSV)和致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(Vp AHPND)在宁波地区养殖南美白对虾中的致病途径和流行规律,采用PCR方法检测了该地区不同养殖模式下南美白对虾及其周边环境和生物中这4种病原的感染情况。结果显示:南美白对虾样本中,WSSV在整个养殖过程中未检出,Vp AHPND阳性率最高,为14.6%,其次是EHP和DIV1,阳性率分别为10.2%和2.9%;土塘养殖模式下对虾病原检出率最高,为61.3%,其次为小棚模式和帆布池模式,病原检出率分别为26.3%和22.2%,大棚养殖的南美白对虾中未检出病原;水样中检出WSSV、EHP、Vp AHPND、DIV1阳性批次数分别为1、14、8、6;底泥样品中未检出病原;周边环境生物中,仅1个批次的脊尾白虾检出EHP阳性。结果表明:4种病原在夏季有较强的流行趋势,需要针对性地加强防控;大棚养殖模式的抗风险能力要高于其他养殖模式,在该模式下水质相对稳定,受外界因素影响较小;病原在底泥和周边环境生物中检出率较低,而在养殖水体中检出率较高,养殖水体可能在南美白对虾感染病原的过程中起着重要的传播媒介作用。因此,在养殖过程中加强水体调控十分重要。

养殖对虾的主要病毒性疾病及其免疫防控措施(2)

1.3虾虹彩病毒病虾虹彩病毒病是一种感染甲壳类的急性、传染性疾病。目前我国主要的甲壳类养殖区域均有该病流行。【病原】病原为十足目虹彩病毒1,属于虹彩病毒科,十足目虹彩病毒属,大小为150-160 nm,核酸类型为DNA,目前已报道的虾血细胞虹彩病毒和红螯螯虾虹彩病毒为该病毒的两个分离株,均可导致虾虹彩病毒病。

凡纳滨对虾病毒性疾病及其防治措施

随着凡纳滨对虾集约化养殖程度不断提高,养殖过程中所发生的病害日趋增多和日益严重,其中以病毒性疾病所造成的损失最为严重,也最难治理。基于此,本文选取了凡纳滨对虾养殖过程中3种常见且危害较大的病毒,对其基本情况进行了简要的概述,并提出了相应的防控措施,以期为凡纳滨对虾养殖者提供参考。

红螯螯虾虹彩病毒结构蛋白质组分析及其囊膜蛋白CQIV-168L鉴定

红螯螯虾虹彩病毒(Cherax quadricarinatus iridovirus,CQIV)是以甲壳动物为主要宿主的线性双链DNA病毒。CQIV对宿主的致死率极高,且传播到我国多个省份养殖场,已成为虾类养殖的重大威胁。然而,目前对该病毒结构蛋白尤其是囊膜蛋白的组成还不清楚。本研究利用液相色谱偶联质谱技术,从纯化的CQIV病毒粒子中鉴定到60个病毒结构蛋白,并选取168L作进一步分析。生物信息学分析表明168L含有3个跨膜结构域。表达时相和药物抑制分析表明168L为病毒晚期基因。免疫印记分析表明168L存在于完整病毒粒子和病毒膜组分中。免疫电镜结果表明168L为病毒囊膜蛋白。本研究结果将为阐明CQIV的结构和感染机制提供新的线索。

早造虾136天出大虾!成活率超80%,“普利茂”阳西早造虾再续高产神话

阳西县是华南地区的养虾重地 之一。但今年开春以来,受气温、雨 水影响,土塘养虾情况不甚理想,弧 菌、孢子虫、虹彩病毒等较为严重, 产量严重下滑,甚至颗粒无收。 在虾农圈流传着一句话,“虾 养的好不好,就看你有没有拿到好的 苗。”土塘养殖的虾,极易受到天气 的影响爆发病害,因此多数土塘虾农 会选择高抗苗进行养殖。

头网亩产240斤,亩利润上万元!高邮罗氏沼虾养殖牛人都在这里

罗氏沼虾因其养殖周期短、回报快而深受养殖户欢迎,但近年来却遭到多种病害困扰,令不少养殖户损失惨重。作为主产地之一的江苏高邮也不例外,每年4~6月份,高邮地区“滴星病”与虹彩病毒频频爆发,今年虹彩病毒发病率更是高达50%~60%。如今又到了罗氏沼虾的上市旺季,小编跟随粤海饲料技术服务团队深入一线,走访了多位民间养虾高手,他们有的头网亩产240斤,有的饵料系数可以控制在1.3,有的年年都能保持“千斤”亩产纪录……让我们这就来揭晓他们成功的秘诀。

上海主养区凡纳滨对虾8种流行病病原监测及分析

为进一步掌握上海地区养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原的流行趋势及特点,定期对上海主养区的凡纳滨对虾开展了8种流行病病原监测及分析工作。51份样品的分子检测和细菌分离鉴定结果显示,有4种病原检测出阳性,其中虹彩病毒1(DIV1)阳性检出率为29.41%,传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)为3.92%,致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(Vp AHPND)为1.96%,副溶血弧菌(Vp)为19.61%;而白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾肝肠胞虫(EHP)等4种病原未检出。408项病原检测结果中,4种病原的阳性总样本数量为28份,总体阳性率为6.86%。结果表明,上海地区养殖凡纳滨对虾的病原携带率处于较低水平,DIV1、副溶血弧菌(Vp)是携带的主要病原。在实际生产中应根据病原流行特点,从苗种选购、养殖过程管理、药物选用等方面进行综合防控,减少病害发生。