水痘带状疱疹病毒蚀斑减少中和试验

〔目的〕建立水痘带状疱疹病毒中和抗体测定方法。〔方法〕用VZV1毒种制备中和抗原 ,以 5 0pfu左右病毒量加待测血清 36℃中和 1h ,接种Vero-E6单层细胞 ,烛缸法培养 10d后 ,用结晶紫染色 ,计数pfu ;以中和后pfu减少 5 0 %的血清最高稀释度为中和抗体滴度。〔结果〕VZV1在Vero -E6细胞上形成的蚀斑呈椭圆形 ,平均Φ0 .85mm ,边界清晰 ;经试验 3只VZV1免前家兔血清中和抗体滴度 <1:2 ,免后分别为 1:16、1:31、1:6 4;5份中和抗体阳性血清经重复测试 3次 ,中和抗体最多相差 1个滴度 ;2 4份血清同时测定VZV中和、荧光、酶标抗体的GMT比值为 1:1.83:46 .2 5。〔结论〕VZV蚀斑减少中和试验特异性、重复性良好 ,可用于VZV疫苗免疫效果考核。

应用蚀斑减少中和试验检测健康人血浆中抗乙型脑炎病毒中和抗体

目的 应用蚀斑减少中和试验,检测健康人血浆中抗乙型脑炎病毒中和抗体水平。方法 采用蚀斑减少中和试验。结果 四川和重庆地区健康人血浆中98％以上含有抗乙型脑炎病毒中和抗体,其中10％的健康人血浆中该抗体滴度高达1:500倍以上。结论 采用蚀斑减少中和试验方法用于健康人血浆中乙型脑炎病毒中和抗体测定是可行的。

应用蚀斑抑制中和法检测乙型脑炎疫苗效力

本文用BHK-21细胞系蚀斑抑制中和法(RRNT)检测乙型脑炎灭活疫苗效力,同时与小鼠免疫攻击法进行比较。PRNT每次均设病毒对照组、P_3免疫血清对照组,并用参考苗作判定标准。在四次试验中,病毒对照组的P值均>0.05;免疫血清对照组的50％空斑形成单位(PFU)减少率均在1:1600附近,重复性好。在小鼠免疫攻击法检测合格的24疫苗中,ID_(50)<0.0001的有4批用PRNT检测不合格,而另外ID50在0.00032～0.0001的8批中,用PRNT检测却全部合格。两法检测结果存在较大差异。

鸭肠炎病毒ul47基因的原核表达及其抗血清中和活性的鉴定

提取鸭肠炎病毒(DEV)基因组DNA,采用PCR方法扩增获得了DEVul47基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-30a-ul47,并转化受体菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析。结果显示,ul47基因在大肠杆菌Rosetta中获得与预期大小相符的表达蛋白。利用Ni-NTA纯化表达蛋白,制备了兔抗DEV UL47蛋白的多克隆抗体,经琼脂双扩散测定,该抗血清效价为1∶16。间接免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验结果显示,DEV UL47蛋白主要定位于感染细胞的细胞质和细胞膜,制备的兔抗DEV UL47多克隆抗体对DEV有中和活性。

人抗乙脑病毒IgG抗体检测试剂盒的研制和应用

乙脑病毒SA14-14-2株疫苗原液经β丙内酯灭活Sepharose 4FF纯化后作为包被抗原，制备阳性替代品，应用间接ELISA法检测人血清中乙脑病毒抗体。建立内部质量控制血清标准，比较蚀斑减少中和试验（PRNT）与ELISA的相关性。检测46份乙脑相关血清的结果与国内同类试剂进行比较，阳性符合率为93．1％，阴性符合率为89．5％。在成安地区3万多名2—14岁人群中进行乙脑病毒IgG抗体水平普查，阳性率22．5％，与国内同类试剂的符合率为95．7％，使用效果很好。

四川地区健康供血浆者SARS-CoV抗体血清学反应初探

目的探索四川地区健康供血浆者SARS-CoV抗体血清学反应情况及其是否对SARS-CoV具有中和作用。方法采用SFDA批准的SARS CoVIgG ELISA试剂盒筛查四川地区7127名健康供血浆者的7248份合格血浆,采用蚀斑中和试验测定单份阳性血浆。结果7248份合格血浆中SARS CoVIgG抗体阳性率平均为5.61%;7127名健康供血浆者中抗体阳性率为3.93%,其中S/CO值>5的阳性率为0.22%。ELISA检测强阳性的单份血浆的最高蚀斑中和抗体效价为166。结论四川地区健康供血浆者中的确存在对SARS-CoV抗体的血清学反应,原因有待于进一步的研究。

华东部分地区12岁以下儿童5型腺病毒感染状况调查

目的调查12岁以下儿童腺病毒（adenovirus，Ad）感染所诱发的免疫力状况，尤其是针对5．型腺病毒（Ad5）的免疫力状况，旨在筛选应用Ad5重组疫苗和基因治疗剂的适宜人群。方法通过采集华东部分省市和地区12岁以下儿童的血清标本，采用ELISA方法检测Ad非特异性总抗体（Ad Total antibody，Ad-TAb），用蚀斑减少中和试验（Plague Reduction Neutralization Test，PRNT）来检测Ad5中和抗体（Ad5 neutralizing antibody，Ad5-NAb），用Stata9．0软件进行数据分析。结果经过ELISA和PRNT检测，发现Ad-TAb和Ad5-NAb的滴度水平以及各组标本的阳性率，均随着年龄的增长而呈上升的趋势。以低于2岁的年龄组各项数据最低，与其它各组有显著性差异（P〈0．05）.结论在12岁以下儿童人群中，以低于2岁的年龄组应用Ad5型重组疫苗或基因治疗剂是可行的。

华东部分地区12岁以下儿童5型腺病毒感染状况调查——用于Ad5型重组载体疫苗或者基因治疗剂的适宜人群筛选

目的调查12岁以下儿童腺病毒（adenovirus，Ad）感染所诱发的免疫力状况，尤其是针对5-型腺病毒（Ad5）的免疫力状况，旨在筛选应用Ad5重组疫苗和基因治疗剂的适宜人群。方法通过采集华东部分省市和地区12岁以下儿童的血清标本，采用ELISA方法检测Ad非特异性总抗体（Ad Total antibody，Ad-TAb），用蚀斑减少中和试验（Plague Reduction Neutralization Test，PRNT）来检测Ad5中和抗体（Ad5 neutralizing antibody，Ad5-NAb），用Stata9．0软件进行数据分析。结果经过ELISA和PRNT检测，发现Ad-TAb和Ad5-NAb的滴度水平以及各组标本的阳性率，均随着年龄的增长而呈上升的趋势。以低于2岁的年龄组各项数据最低，与其它各组有显著性差异（P〈0．05）。结论在12岁以下儿童人群中，以低于2岁的年龄组应用Ad5型重组疫苗或基因治疗剂是可行的。

用双抗夹心ELISA法快速检测灭活乙型脑炎疫苗的效价

目的：用单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA法快速检测灭活乙型脑炎疫苗中的乙型脑炎病毒包膜蛋白（E）的含量,并探讨其替代蚀斑减少中和试验法的可行性。方法：将疫苗样品用蚀斑减少中和试验法测定,同时选定一批疫苗为参考疫苗,用双抗夹心ELISA法检测。结果：用双抗夹心ELISA法测得的中和指数（TE）为1.595-1.655。用蚀斑减少中和试验法测得的中和指数（TP）为1.367-1.932。经F检测,两种检测方法的灵敏度有极显著差异（F=56.25,P〈0.01）,用t检验法对这两种检测方法进行统计分析,表明两组测定值的差异无统计学意义（t=0.079 3,P〉0.05）。结论：双抗夹心ELISA法与蚀斑减少中和试验法测得的中和指数（T）呈正相关性;与蚀斑减少中和试验法比,双抗夹心ELISA法具有重复性好、成本低、快速等优点。用双抗夹心ELISA法取代蚀斑减少中和试验法测灭活乙型脑炎疫苗效价是可行的。

新生牛血清中乙脑抗体的检测及其方法的建立

对新生牛血清中的抗乙型脑炎病毒的抗体进行检测,并且建立一种有效可行的检测方法。以四个厂家共16批新生牛血清用蚀斑减少中和法(PRNT)对其中的乙脑抗体进行了检测。结果显示该方法检测出部分批次的新生牛血清中含有抗乙脑病毒抗体,且乙脑抗体阳性牛血清可将乙脑病毒抗原中和,对蚀斑数有较明显影响。证明作为检测牛血清中乙脑抗体的有效方法,PRNT法具有灵敏度高、重复性好的优点。以上检测说明新生牛血清中存在乙脑抗体,能将乙脑病毒中和。用于乙脑减毒活疫苗生产的新生牛血清除按照《中国生物制品主要原辅材料质控标准》进行质控外,还应进行乙脑抗体的检测。

贵州省成人流行性乙型脑炎病毒中和抗体水平调查

目的调查贵州省成人流行性乙型脑炎(乙脑)病毒中和抗体水平。方法采用多阶段随机抽样的方法,在2017年5～6月采集3个市(州) 6个年龄组健康成人血清共360份,应用蚀斑减少中和试验法检测乙脑病毒中和抗体。结果 360名调查对象中乙脑病毒中和抗体阳性率为55. 28%,几何平均滴度(GMT)为1∶17. 52。不同性别(X^2=10. 798,P=0. 001)、不同发病率地区(X^2=6. 090,P=0. 048)成人乙脑病毒中和抗体阳性率差异具有统计学意义(均有P <0. 05);不同年龄成人乙脑病毒中和抗体阳性率在45. 00%～60. 00%之间(X^2=4. 236,P=0. 516);不同民族中,布依族成人乙脑病毒中和抗体阳性率最高(79. 17%)。结论贵州省成人乙脑病毒中和抗体水平较低,存在成人乙脑流行风险。

麻疹IgG抗体定量检测酶联免疫吸附试验试剂的比较和评价

目的对目前中国市场上已有的两种麻疹IgG抗体定量检测酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)试剂(德国Virion/Serion试剂和德国IBL试剂)进行比较和评价,筛选适用于2006年全国人群麻疹血清流行病学调查的试剂。方法以蚀斑减少中和试验(Plague Reduction Neutralization Test,PRNT)的检测结果为"金标准",分别用两种ELISA试剂检测52份麻疹IgG抗体组合血清,然后对试剂的定性和定量能力进行全面分析和评价。结果两种ELISA试剂均能正确的将13份PRNT结果为阴性的血清判定为阴性,特异度均为100%。两种试剂中,Virion/Serion试剂的敏感度为94.9%,与PRNT结果的相关性Kappa值为0.902,相关系数为0.878(P<0.01);IBL试剂敏感性为58.8%,与PRNT结果的相关性Kappa值为0.441,相关性系数为0.850(P<0.01)。结论Virion/Serion试剂的特异性、敏感性较好,有单孔IgG抗体定量能力,价格适中,适于在自动化工作平台工作站中开展大规模血清样本的检测。

酶联免疫吸附试验定量检测人抗流行性乙型脑炎病毒IgG抗体方法的研究

为建立快速检测人抗流行性乙型脑炎 (乙脑 )病毒抗体的方法 ,用纯化乙脑病毒选择实验条件 ,通过与蚀斑减少中和试验 (PRNT)的比较 ,确定保护性抗体的酶联免疫吸附试验 (ELISA)的尺度 ,再对两种方法进行比较。结果 :ELISA比PRNT法灵敏度高 16～ 32倍。两种方法有良好的线性关系 (r=0 771,P<0 0 0 1)。PRNT法 1∶10抗体滴度对应的ELISA结果为 0 331U ,两种方法差异无显著的统计学意义 (χ2 =0 14 2 ,P >0 0 5 ) ,总符合率为 81 3%。

冻干精制Vero细胞流行性乙型脑炎灭活疫苗在低流行区的人体反应及免疫效果

为了进一步观察冻干精制猴肾传代细胞 (Vero细胞 )流行性乙型脑炎 (乙脑 )灭活疫苗 (Vero细胞乙脑疫苗 )的接种反应及免疫效果 ,在乙脑的低流行区内蒙古自治区选择 6～ 9岁未接种过乙脑疫苗的健康儿童为观察对象 ,分别接种Vero细胞乙脑疫苗、原代地鼠肾细胞 (PHK)乙脑灭活疫苗和乙脑减毒活疫苗。结果显示 :接种第 1剂Vero细胞乙脑疫苗后体温中、强反应率为 5 6 % ,未见局部及其它全身反应 ,接种第 2剂后只有 1人为中反应 ;用Vero细胞乙脑疫苗基础免疫 2针后 1个月 ,血清中和抗体阳转率和几何平均滴度 (GMT)分别为 1 0 0 0 %和 1∶2 5 30 ,显著高于PHK乙脑灭活疫苗的 56 8%和 1∶8 83 ,亦显著高于乙脑减毒活疫苗 1针免疫后的 60 7%和 1∶8 35 ;用Vero细胞乙脑疫苗基础免疫 2针 1年后中和抗体阳性率及GMT分别为 50 0 %和 1∶7 42 ,加强免疫后中和抗体阳性率为 1 0 0 0 % ,GMT达 1∶2 2 0 1 ,≥ 4倍增长率为 95 1 % ,加强免疫前后差异显著。由此可见 ,用Vero细胞乙脑疫苗对学龄儿童进行基础免疫或加强免疫 。

首批人抗乙型脑炎病毒血清候选国家标准品的研制

目的研制首批人抗乙型脑炎病毒血清候选国家标准品,用于乙型脑炎病毒中和抗体检测和乙型脑炎疫苗免疫效果评价。方法采用乙型脑炎病毒中和抗体阳性的人血浆为原料,去除纤维蛋白原、灭活补体后分装冻干制成人源抗乙型脑炎病毒血清国家标准品。组织2家单位协作标定,并对候选标准品进行稳定性观察。结果研制批号为201801人抗乙型脑炎病毒血清候选标准品共5000余支;其外观、水分、无菌检查和分装精度等均符合《中华人民共和国药典》2020版(三部)要求。人源抗乙型脑炎病毒血清国家标准品中和抗体效价赋值为1∶123.8~1∶202.2,且在4℃保存3年中和抗体效价稳定。结论该批人抗乙型脑炎病毒血清可作为国家标准品用于乙型脑炎疫苗临床血清中和抗体效价检测和乙型脑炎疫苗质量控制。

冻干精制Vero细胞流行性乙型脑炎灭活疫苗在流行区的人体反应及免疫效果

为了进一步观察冻干精制Vero细胞流行性乙型脑炎 (乙脑 )灭活疫苗 (Vero细胞乙脑疫苗 )的接种反应及免疫效果 ,在乙脑流行区江苏省苏州市吴中区选择 6～ 18月龄未接种过乙脑疫苗的健康婴幼儿为观察对象 ,分别接种Vero细胞乙脑疫苗、原代地鼠肾细胞 (PHK)乙脑灭活疫苗和乙脑减毒活疫苗。结果显示 :接种Vero细胞乙脑疫苗第 1剂后体温中、强反应率为 12 4 % ,未见局部及其它不良反应 ;接种第 2剂后无发热反应。用Vero细胞乙脑疫苗免疫 2针后 1个月 ,血清中和抗体阳转率和几何平均滴度 (GMT)分别为 10 0 0 %和 1∶2 7 7,显著高于PHK乙脑灭活疫苗和乙脑减毒活疫苗的免疫后血清学效果。用Vero细胞乙脑疫苗初免的儿童 ,1年后抗体阳性率与GMT分别为 88 3%和 1∶2 6 4 ,用同一种疫苗加强免疫后抗体阳性率与GMT分别为 10 0 0 %和 1∶2 80 1。此外 ,用Vero细胞乙脑疫苗对该区的 1～ 6岁已接种过乙脑疫苗的儿童进行加强免疫 ,结果显示 :免疫前阳性率与GMT分别为 6 8 2 %和 1∶10 2 ,免疫后阳性率为 10 0 0 % ,GMT达 1∶2 32 4 ,≥ 4倍增长率为 98 5 % ,加强免疫前后差异显著。由此可见 ,用Vero细胞乙脑疫苗对儿童进行初免或加强免疫 ,除初免第 1针有一过性发热外 ,无其它不良反应 ,血清学效果明显优于PHK乙?

呼吸道合胞病毒抗体效价3种检测方法的建立及比较

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)抗体效价的3种检测方法,并进行比较。方法棋盘滴定法优化ELISA法的包被抗原及酶标二抗的浓度,并检测该方法的线性范围及重复性;同时建立微量细胞中和试验法和蚀斑减少中和试验法,检测两种方法的重复性。用建立的3种方法及市售RSV抗体ELISA检测试剂盒同时检测55份健康人血清样本,并将两种ELISA法与两种中和抗体效价检测方法间的相关性进行两两比较。结果 ELISA法中包被抗原为10μg/ml及HRP标记的山羊抗人Ig G稀释度为1∶30 000时是最佳组合;在38.00~2.375 U/ml范围内,抗体浓度与A_(450/630)值呈良好线性关系,R^2=0.981 4;高、中、低3个浓度样本的变异系数(CV)均<10%。微量细胞中和试验7 d后,细胞病变明显,细胞成片脱落;连续6次检测抗RSV多克隆抗体中和效价的CV值为4.2%。RSV感染Vero细胞7 d后出现明显的蚀斑形态,结晶紫染色后蚀斑边缘清晰;连续6次检测兔抗RSV抗血清效价的CV值为6.81%。本实验建立的ELISA法与市售ELISA试剂盒的相关系数(R)为0.787,微量细胞中和试验与蚀斑减少中和试验的R为0.937。结论成功建立了3种RSV抗体效价检测方法,本实验建立的ELISA法与市售ELISA试剂盒间及两种中和抗体检测方法间具有良好的相关性。