H5N1亚型禽流感病毒鸡胚分离株蚀斑克隆及生物学特性比较

建立了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)蚀斑克隆方法,用不加中性红的营养琼脂为覆盖层,在倒置显微镜下挑斑,对3株H5N1亚型AIV鸡胚分离毒株进行了蚀斑克隆纯化,从同一鸡胚分离毒株中纯化得到了蚀斑大小和形态均存在显著差异的毒株,共获得13株蚀斑克隆纯化株。研究结果表明,当小牛血清浓度为2%时,加入终浓度50μg/ml的胰酶可明显促进和刺激蚀斑的形成,蚀斑的直径和PFU/ml均有显著的增加。通过TCID50、EID50和LD50测定发现,来自同一鸡胚分离株的不同蚀斑克隆纯化株中,蚀斑大、毒力强的克隆毒株占优势,而且蚀斑较大的,其毒力也较强。对得到的13株蚀斑克隆毒株的全基因组各片段序列分析表明,蚀斑克隆纯化株在HA蛋白裂解位点附近的氨基酸序列均符合高致病性通报性禽流感病毒的分子特征。

新城疫疫苗株与分离毒株的蚀斑克隆与毒力鉴定

2株NDV贵州分离株(GN、ND99)与2株疫苗毒株(Ⅰ系和Ⅱ系)经检测为生物异质性毒株。利用蚀斑克隆技术对以上4株毒株进行蚀斑纯化,结果得到11株克隆毒株。其中,10株克隆毒株在鸡胚成纤维细胞上形成圆形、透明无色蚀斑,1株形成圆形、透明、红色蚀斑。经RT-PCR检测,11株克隆毒株中6株为弱毒,形成蚀斑的大小在0.4～0.8mm之间;5株为强毒,形成蚀斑的大小在1.0～2.0mm之间。结果表明:所形成蚀斑的大小与病毒毒力具有一定的相关性。

几株新城疫分离毒蚀斑形成及其克隆毒某些特性的研究

对分离白黑龙江省内不同地区的7株新城疫强毒进行了蚀斑亚群测定,并对运用蚀斑克隆化技术制成的蚀斑克隆毒的特性进行了比较。结果表明,5株形成中小清亮蚀斑;1株只形成小的清亮蚀斑;另一株除形成中小清亮蚀斑外,还形成小的红蚀斑。对蚀斑克隆毒毒力测定结果表明,各中清蚀斑克隆毒的毒力均大于同源的小清蚀斑克隆毒,而小红蚀斑克隆毒的毒力明显高于同源的其它蚀斑克隆毒和母毒株。这几林蚀斑克隆毒在血凝特性上也有所区别。

乙型脑炎病毒HW_1克隆纯化株的鉴定及外源性污染的检定

应用病毒蚀斑技术，将乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）ＨＷ１株在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）单层培养上连续挑斑纯化３次，对纯化后的克隆株进行血清学、免疫生物学鉴定及外源性污染检定。毒株对ＢＨＫ－２１细胞感染滴度≥１０６．１５ＴＣＩＤ５０；对８～９ｇ小鼠脑内感染的毒力≥１０７．１０ＬＤ５０／０．０４ｍＬ；与ＪＥＶＰ３株阳性参考血清的中和指数≥２０００；克隆株对猪有较好的免疫原性，无外源性污染。

江汉平原—规模化猪场暴发伪狂犬病的调查研究(Ⅲ)——猪伪狂犬病毒HS-9304株的克隆纯化及检定

应用细胞培养病毒蚀斑技术,将分离的伪狂犬病毒(PrV)HS-9304株在鸡胚成纤维细胞(CEF)单层培养上覆以营养琼脂培养基,连续挑斑纯化3次,成功地获得了纯化病毒克隆株.对病毒克隆株在传代细胞上复壮增殖后进行毒价测定.接种试验动物人工造病并进行血清中和试验以及外源性污染的检定.该病毒克隆株对BHK-21细胞感染的滴度为10^(8.5)TClD_50,能使小鼠和家兔出现特异性的症状和死亡,病毒对PrV标准阳性血清的中和效价达到1:195.病毒纯净无外源性污染.

高增殖力PRRSV美洲株LY-1株的克隆筛选及安全性试验

通过蚀斑克隆技术从原有弱毒疫苗株中筛选到一株高增殖力弱毒株LY-1株,其在Marc-145细胞上TCID50达107.85/mL,显著高于原始毒株及同期克隆到的其它毒株,且在细胞上传代50代效价依然稳定。对妊娠母猪及断奶仔猪均安全。

伪狂犬病弱毒克隆株LY-C6株的试验免疫研究

在流行病学调查中分离到 1株病毒 ,经鉴定为伪狂犬病毒弱毒株命名为LY株。应用蚀斑筛选方法对其进行了蚀斑克隆纯化 ,将克隆后的该毒株命名为猪伪狂犬病病毒LY -C6株。克隆株除对家兔有一定致病力外、对 5日龄乳猪及妊娠母猪都有很高的安全性。该克隆株对新生乳猪、断乳仔猪及妊娠母猪的最小免疫量分别为 1 0 2 80 、 2× 1 0 2 80 、 4× 1 0 2 80 TCID50 ,抗体中和指数达到 3 1 6可获得攻毒保护 ,对新生乳猪、断乳仔猪的免疫持续期为 2 40天 ,免疫妊娠母猪其后代可获高滴度的母源抗体 ,至少可使 2

猪伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及UL43基因序列分析

从四川某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该毒株能在Vero、MDBK、PK15、ST、MDCK、BHK21、Marc145、鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在Vero细胞上为3.0×107TC ID50/0.1mL。该病毒在Vero细胞上连传15代,其TCID50变化很小。病毒对5-溴脱氧尿核苷、氯仿敏感。用该病毒接种家兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状,gE-ELISA检测接种分离毒的仔猪血清,伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性。电镜观察可见直径110～140 nm的典型疱疹病毒粒子。上述结果表明分离株为PRV,并命名为SE株。根据已发表的UL43序列设计1对引物,以分离毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增,对目的产物进行克隆及测序分析,结果与GenBank收录的其他PRV毒株(Becker、Ea)的UL43核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸同源性分别为95.2%、97.3%。