犬瘟热病毒的蚀斑克隆试验

对血清、胰酶以及染色时间等可能影响犬瘟热病毒蚀斑形成的条件进行了摸索。结果发现 ,对必须同步接毒的CDV小熊猫 (LP)株来讲 ,其形成蚀斑的最佳条件是 :同步接毒 10h后 ,加入血清含量为 2 %的无酚红的DMEM营养琼脂 ,第 5d时 ,加入 1/ 5体积的胰酶含量为 1/ 80 0 0的含中性红的DMEM营养琼脂染色 ,于第 6d时 ,便可形成蚀斑。挑选不同大小的蚀斑 ,克隆 3次后 ,获得了蚀斑直径为 0 .4～ 0 .6 ,0 .6～ 0 .8及 0 .7～ 0 .

普通大气条件下的蚀斑试验

草鱼出血病病毒湖南邵阳株(CCHV—873),常规培养条件下能在鱼肾(CIK)细胞上形成直径约2mm的蚀斑。当采用三种缓冲系统(MFM-NaHCO_3、MEM-Tris、MEMHEPES)的培养液在普通大气条件下分别培养CIK细胞时,三天内培养液的pH略有变化,其变化范围在0.2—0.4左右,但细胞生长仍然良好,三者无明显差别。在上述系统,以双相法(培养液-凝胶)进行蚀斑试验时,观察到无机缓冲系统培养液的pH变化较大,有机缓冲系统则较稳定,且蚀斑形成的数量显著不同,后者效价比前者要高出4个数量级。因此,在培养液中加入适量的有机缓冲液代之以CO_2的调节是完全有可能的。

用蚀斑抑制试验研究中国脊髓灰质炎Ⅰ型流行毒株的株间差异

利用株特异性的抗Sabin-I株与抗Brunhilde株的豚鼠免疫血清进行蚀斑抑制试验,以研究Polio-I型毒株的型内差异。对国内近年分离株的分析结果表明,Sabin-I疫苗株抗体对不同地区流行株的中和效果有明显差异,对徐州与云南流行的野毒株的中和效果较好,只需160单位(中和单位)的抗体即可达到80％的抑制率,而对山东、广西两暴发流行区的野毒株,则需1280才能抑制80％,相差8倍。对北京地区野毒株的抑制率介于上述两类毒株之间,与对Mahoney株的抑制率相近似。该方法以测中和抗体为基础,但比常规中和试验法更精确,是一种简便、客观、有效的研究型内差别的分析手段,具有重要的理论和实际意义。

水痘带状疱疹病毒蚀斑减少中和试验

〔目的〕建立水痘带状疱疹病毒中和抗体测定方法。〔方法〕用VZV1毒种制备中和抗原 ,以 5 0pfu左右病毒量加待测血清 36℃中和 1h ,接种Vero-E6单层细胞 ,烛缸法培养 10d后 ,用结晶紫染色 ,计数pfu ;以中和后pfu减少 5 0 %的血清最高稀释度为中和抗体滴度。〔结果〕VZV1在Vero -E6细胞上形成的蚀斑呈椭圆形 ,平均Φ0 .85mm ,边界清晰 ;经试验 3只VZV1免前家兔血清中和抗体滴度 <1:2 ,免后分别为 1:16、1:31、1:6 4;5份中和抗体阳性血清经重复测试 3次 ,中和抗体最多相差 1个滴度 ;2 4份血清同时测定VZV中和、荧光、酶标抗体的GMT比值为 1:1.83:46 .2 5。〔结论〕VZV蚀斑减少中和试验特异性、重复性良好 ,可用于VZV疫苗免疫效果考核。

用蚀斑形成试验分离虫媒病毒

本文报告用蚀斑形成试验分离虫媒病毒。从643个蚊虫混合标本中分离到乙脑病毒104株,甲病毒1株。经过C6/36白纹伊蚊细胞增殖后,标本阳性率为14.2％,直接从蚊虫混合标本分离的阳性率为13.2％,前者的蚀斑数显著高于后者(P<0.001)。乙脑病毒蚀斑于接种后第4～9天出现,直径约6mm,边缘较模糊。甲病毒蚀斑于接种后第2～3天出现,直径1～2mm,较乙脑病毒小。用蚀斑形成试验分离虫媒病毒的优点是可以根据蚀斑的形态和出现时间,初步区别分离物是甲病毒属或黄病毒属。

应用蚀斑减少中和试验检测健康人血浆中抗乙型脑炎病毒中和抗体

目的 应用蚀斑减少中和试验,检测健康人血浆中抗乙型脑炎病毒中和抗体水平。方法 采用蚀斑减少中和试验。结果 四川和重庆地区健康人血浆中98％以上含有抗乙型脑炎病毒中和抗体,其中10％的健康人血浆中该抗体滴度高达1:500倍以上。结论 采用蚀斑减少中和试验方法用于健康人血浆中乙型脑炎病毒中和抗体测定是可行的。

采用蚀斑技术克隆纯化口蹄疫病毒的研究

本研究应用BHK21细胞通过蚀斑试验克隆和再次克隆牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒AKT03毒株并对克隆前和第1次、第2次克隆的口蹄疫病毒毒株的细胞半数感染量(TCID50)、乳鼠半数致死量(LD50)进行比较测定,结果表明,通过蚀斑试验成功克隆了牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒AKT03毒株,第1次克隆的毒株和第2次克隆的毒株TCID50和LD50效价明显提高。

蚀斑法分离纯化BHV-1和BPIV-3混合病毒

利用蚀斑试验方法对牛疱疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒进行分离纯化及鉴定,为BHV-1、BPIV-3感染的诊断提供科学依据。将不同稀释度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接种至牛肾原代细胞,加营养琼脂培养,产生蚀斑后扩增并RT-PCR鉴定。将纯化后毒液分别进行二次蚀斑纯化及鉴定。结果 BHV-1和BPIV-3混合病毒第6~7 d可产生明显蚀斑。鉴定阳性的BHV-1和BPIV-3进行二次蚀斑,鉴定结果均为阳性,且分离的两种病毒TCID_(50)测定结果为10^(-8.5)/0.1 m L、10^(-6.5)/0.1 m L。首次通过蚀斑试验,成功分离并得到了两株毒力较高且纯化的BHV-1和BPIV-3病毒株。

应用蚀斑抑制中和法检测乙型脑炎疫苗效力

本文用BHK-21细胞系蚀斑抑制中和法(RRNT)检测乙型脑炎灭活疫苗效力,同时与小鼠免疫攻击法进行比较。PRNT每次均设病毒对照组、P_3免疫血清对照组,并用参考苗作判定标准。在四次试验中,病毒对照组的P值均>0.05;免疫血清对照组的50％空斑形成单位(PFU)减少率均在1:1600附近,重复性好。在小鼠免疫攻击法检测合格的24疫苗中,ID_(50)<0.0001的有4批用PRNT检测不合格,而另外ID50在0.00032～0.0001的8批中,用PRNT检测却全部合格。两法检测结果存在较大差异。

猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定

从上海某猪场发病仔猪体内分离到 1株病毒 ,该毒株能在鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK2 1、ST、PK15细胞上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化 ,克隆毒株在BHK2 1细胞上的TCID50 为 5 0 μL 10 -6.68稀释液。该病毒能被伪狂犬病毒 (PRV )阳性血清中和。接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应。电镜观察可见直径 110～ 180nm的典型疱疹病毒粒子。用该病毒接种兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状。表明该分离毒株为PRV。

犬瘟热病毒小熊猫株的驯化致弱及其免疫研究

犬瘟热病毒 (CDV)小熊猫低代强毒 (LPV9)经MDCK、CRFK和Vero细胞分别传至 2 1、2 0、2 0代 ,并采用蚀斑技术对传代毒进行克隆。病毒每传 2 0代进行 1次致弱程度鉴定 ,结果表明LPV9随所传代数增加 ,对幼犬的致病性逐渐减弱 ,至第 70代 (LPV70 )时 ,对接种犬失去了致病性。 2个组犬按每只 1× 10 4 TCID50 ,分别接种LPV70 和疫苗弱毒复壮株R 2 0 /8,14d后前者刺激接种幼犬产生的中和抗体效价均大于 1∶10 0的完全保护价 ,而后者则有低于 1∶10 0的 (攻毒保护率分别为 5 /5和 4/5 ) ,故驯化致弱的LPV70 免疫原性要好于疫苗弱毒复壮株R 2 0 /8。将LPV70 分别在细胞上连续 2 0代、在幼犬连续传代 5代后 ,其细胞培养物及从动物体内回收的病毒免疫原性及安全性能够稳定遗传。

水中脊髓灰质炎病毒感染性、抗原性及核酸指标检测方法的评价研究

目的：建立水中脊髓灰质炎病毒1型（PV1）感染性、抗原性及核酸检测指标并比较三种指标的优缺点．方法：分别用蚀斑计数（PFUA）、免疫印迹（DIBA）和逆转录PCR（RT－PCR）三种方法检测病毒感染性、抗原性和核酸片段完整性，并比较各方法的敏感性和特异性．结果：RT－PCR对PV1有株特异性，DIBA则对PV1有型特异性，而PFUA对PV1无型间及株间特异性；PFUA，RT－PCR和DIBA对PV1Henan株（105TCID50／mL）最低检出稀释度分别为5×10-5，5×10-5和1×102．结论：PFUA有较高的敏感性，但存在缺乏特异性，sd～7d的检测时间及因需细胞培养造成的不易操作、高经费支出等缺陷．DIBA虽有型特异性，但敏感性差，目因靠肉眼判断结果判定误差大．RT－PCR结果快速、特异、敏感、操作简便、省时省力．

水源中肠道病毒及胃肠炎病毒检测方法的研究进展及意义

人肠道病毒及胃肠炎病毒借助水体传播可能引起水源影响区域的疫情暴发。尤其对免疫力发育尚不完全的儿童和免疫缺陷人群,这些病毒感染可能会引起严重的临床症状和并发症。因此,做好水源中肠道病毒及胃肠炎病毒的检测和监测,将对这些病毒所致疾病的防范和控制有重要意义。本文综述了目前国内外针对水体中的病毒浓缩和检测所做的相关研究,包括从水样中浓缩、纯化病毒的不同方法及建立在分子生物学和细胞培养基础上的病原检测方法。这些研究为进一步建立行业标准和实验室检测规范提供了重要的参考和技术依据。

不同细胞对乙型脑炎病毒蚀斑减少中和试验的影响

目的分别使用不同细胞测定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)滴度及乙型脑炎灭活疫苗效价,分析不同细胞对检测结果的影响。方法将JEV P3株接种至长满单层的MDBK、Vero、LLC-MK2、BHK-21细胞的6孔板,采用蚀斑试验测定JEV的PFU;将乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)免疫小鼠,取静脉血,分离血清,经56℃灭能30 min后,与JEV P3株混合,接种至长满单层的Vero、BHK-21、LLC-MK2细胞的6孔板,采用蚀斑减少中和试验检测乙型脑炎灭活疫苗的效价。结果 JEV在4种细胞上均可产生细胞病变(cytopathic effect,CPE),但在MDBK细胞上不形成蚀斑,病毒感染的Vero、LLC-MK2、BHK-21细胞的收获液病毒滴度分别为10.02、9.42和9.21 lg PFU/ml;3种细胞测定乙型脑炎灭活疫苗效价T值Vero>LLC-MK2>BHK-21,其中Vero细胞与BHK-21和LLC-MK2细胞比较,蚀斑减少率及对应T值差异有统计学意义(P<0.05),LLC-MK2与BHK-21细胞比较,蚀斑减少率及对应T值差异无统计学意义(P>0.05)。结论 4种细胞感染JEV后均可产生CPE,但MDBK细胞不能形成蚀斑;不同细胞测定疫苗效价,蚀斑减少率及对应T值也不同,其中Vero细胞测定T值最大,BHK-21细胞测定T值最小。

蓝舌病病毒甘肃分离株的定型研究

继利用蚀斑抑制中和试验对蓝舌病病毒山东分离株（L001）进行血清型鉴定后，又对蓝舌病病毒甘肃分离株进行了血清型鉴定，证实甘肃分离株为蓝舌病病毒11型。

人抗乙脑病毒IgG抗体检测试剂盒的研制和应用

乙脑病毒SA14-14-2株疫苗原液经β丙内酯灭活Sepharose 4FF纯化后作为包被抗原，制备阳性替代品，应用间接ELISA法检测人血清中乙脑病毒抗体。建立内部质量控制血清标准，比较蚀斑减少中和试验（PRNT）与ELISA的相关性。检测46份乙脑相关血清的结果与国内同类试剂进行比较，阳性符合率为93．1％，阴性符合率为89．5％。在成安地区3万多名2—14岁人群中进行乙脑病毒IgG抗体水平普查，阳性率22．5％，与国内同类试剂的符合率为95．7％，使用效果很好。

鸭肠炎病毒ul47基因的原核表达及其抗血清中和活性的鉴定

提取鸭肠炎病毒(DEV)基因组DNA,采用PCR方法扩增获得了DEVul47基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-30a-ul47,并转化受体菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析。结果显示,ul47基因在大肠杆菌Rosetta中获得与预期大小相符的表达蛋白。利用Ni-NTA纯化表达蛋白,制备了兔抗DEV UL47蛋白的多克隆抗体,经琼脂双扩散测定,该抗血清效价为1∶16。间接免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验结果显示,DEV UL47蛋白主要定位于感染细胞的细胞质和细胞膜,制备的兔抗DEV UL47多克隆抗体对DEV有中和活性。

华东部分地区12岁以下儿童5型腺病毒感染状况调查

目的调查12岁以下儿童腺病毒（adenovirus，Ad）感染所诱发的免疫力状况，尤其是针对5．型腺病毒（Ad5）的免疫力状况，旨在筛选应用Ad5重组疫苗和基因治疗剂的适宜人群。方法通过采集华东部分省市和地区12岁以下儿童的血清标本，采用ELISA方法检测Ad非特异性总抗体（Ad Total antibody，Ad-TAb），用蚀斑减少中和试验（Plague Reduction Neutralization Test，PRNT）来检测Ad5中和抗体（Ad5 neutralizing antibody，Ad5-NAb），用Stata9．0软件进行数据分析。结果经过ELISA和PRNT检测，发现Ad-TAb和Ad5-NAb的滴度水平以及各组标本的阳性率，均随着年龄的增长而呈上升的趋势。以低于2岁的年龄组各项数据最低，与其它各组有显著性差异（P〈0．05）.结论在12岁以下儿童人群中，以低于2岁的年龄组应用Ad5型重组疫苗或基因治疗剂是可行的。

四川地区健康供血浆者SARS-CoV抗体血清学反应初探

目的探索四川地区健康供血浆者SARS-CoV抗体血清学反应情况及其是否对SARS-CoV具有中和作用。方法采用SFDA批准的SARS CoVIgG ELISA试剂盒筛查四川地区7127名健康供血浆者的7248份合格血浆,采用蚀斑中和试验测定单份阳性血浆。结果7248份合格血浆中SARS CoVIgG抗体阳性率平均为5.61%;7127名健康供血浆者中抗体阳性率为3.93%,其中S/CO值>5的阳性率为0.22%。ELISA检测强阳性的单份血浆的最高蚀斑中和抗体效价为166。结论四川地区健康供血浆者中的确存在对SARS-CoV抗体的血清学反应,原因有待于进一步的研究。