蚯蚓酶治疗脑血栓形成的临床探讨

脑血管意外是急诊中的常见病,其中脑血栓形成的发病率随我国人口老年化有逐年上升趋势,对本病的防治已成为脑血管与疾病研究中的重要内容。本文在我院从蚯蚓中提取具有纤溶活性的纤溶酶研究,以及严密观察正常志愿者口服蚯蚓酶的基础上,进行了19例患者口服蚯蚓酶的治疗,以8例未服此药治疗作为对照,检测了凝血和纤溶方面实验指标,用药前后进行了神经功能缺损评分,证明了蚯蚓酶应用于临床治疗脑血栓形成病例的良好效果,并且在所有治疗病例观察中,末发现有明显的毒性副作用,因而在当前治疗血栓性疾病尚缺乏较为理想的药物情况下,蚯蚓酶在临床上应用可能有其广阔的远景。

蚯蚓纤溶酶的抗肿瘤作用

目的 观察蚯蚓纤溶酶 (EFE)对体外人癌细胞株及体内人癌裸鼠移植性肿瘤生长的影响 ,对该药进行临床前抗肿瘤药效学评价。方法 采用MTT法观察蚯蚓纤溶酶对体外人癌细胞的生长抑制作用 ;用人胃癌BGC82 3和人乳腺癌B37裸鼠移植性肿瘤模型对蚯蚓纤溶酶进行体内抗肿瘤药效学观察。结果 蚯蚓纤溶酶在体外对人癌细胞的生长无抑制作用 ;灌胃给予蚯蚓纤溶酶 2 0 0～ 10 0 0mg·kg-1,可明显抑制人胃癌BGC82 3和人乳腺癌B37裸鼠移植性肿瘤的生长。结论 蚯蚓纤溶酶具有抗肿瘤作用。

蚯蚓溶栓酶基因的克隆及非融合性表达

目的 克隆和表达我国特有的双胸蚓属蚯蚓 (Lumbricusbimastus)体内一种具有纤溶活性的蛋白质。方法 通过蛋白质N 末端测序、引物设计及合成、RT PCR得其对应的cDNA ,随后构建了 pBV2 2 0 P3 0 重组质粒 ,在大肠杆菌DH5α中进行非融合性表达 ,再经亲和色谱柱纯化复性 ,得到重组蚯蚓溶栓酶蛋白。结果 克隆cDNA全长 888bp ,编码含 2 4 2个氨基酸的成熟肽 ,SDS PAGE电泳显示分子量在 30× 10 3 左右 ,因此将其命名为P3 0 ,经活性测定 ,具有纤溶活性。结论 P3 0 为首次发现的新基因 ,在国际基因库的输入号为GenebankAF 10 96 4 8,并获得国家专利 ,专利号为 9810 2 2 5 7.X。

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其部分酶学性质的研究

以野生环毛蚓 (Pheretima)为材料 ,经匀浆抽提、热变性、硫酸铵分步沉淀、SephadexG 75凝胶过滤和DEAE 纤维素离子交换柱层析等纯化步骤 ,得到纯度较高的蚯蚓纤溶酶 (EFE) ,具有强烈的溶解血纤维蛋白的作用。同时对酪蛋白和BAEE也具有较强的水解作用 ,但对ATEE无水解活性。实验表明蚯蚓纤溶酶能被苯甲磺酰氟强烈抑制 ,说明该酶是丝氨酸蛋白酶、属胰蛋白酶类。金属离子Na+、K+、Mg2 +对此酶有一定的抑制作用 ,Hg2 +对EFE有强烈抑制作用 ,而Ca2

一种测定蚯蚓纤溶酶活力的简易方法

在全面考查温度、底物浓度、酶浓度和酶促反应时间等条件的基础上，改进了用合成底物BAEE测定蚯蚓纤溶酶的方法。该法重复性好，测试条件易于控制，可用于蚯蚓纤溶酶生产的质量控制。

蚯蚓纤溶酶新基因PV_(242)的克隆与表达

从我国特有的双胸蚓属 (Lumbricusbimastus)蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质 ,采用聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)微量测序法测得蛋白质的N端氨基酸序列 ,依此设计简并引物 ,通过RT PCR获得其对应cDNA .该cDNA全长 888bp ,1～ 72 6位核苷酸对应读码框架 (ORF) ,编码含 2 4 2个氨基酸的成熟肽 .终止子 (TAG)位于cDNA的 72 7～ 72 9位 ,其余核苷酸序列为 3′端非编码区 .成熟肽命名为蚯蚓纤溶酶PV2 42 .蛋白质预测得知蛋白质等电点为 4 33,含组氨酸 (His4 4 )及丝氨酸 (Ser191)两个活性位点 ;蛋白质由两个结构域组成 ,表面有活性裂隙 ;该蛋白质属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类 .经国际基因库等多种查询比较未见PV2 42 基因的报道 ,为首次发现的新基因 ,在国际基因库的输入号为GenBankAF10 96 4 8.随后构建了pTrxFUS PV2 42 重组质粒 ,并在大肠杆菌GI72 4中获得融合蛋白TrxA/PV2 42 的可溶性表达 ,采用离子交换层析法纯化表达蛋白 ,融合蛋白有纤维平板溶解活性 .

蚯蚓纤溶酶抗肝癌转移作用的实验研究

目的探讨蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)对人肝癌细胞转移的影响。方法建立裸鼠人肝癌高转移原位移植瘤模型,造模后7d将裸鼠随机分为模型对照组和EFE高、低剂量组,共3组,每组7只,每天分别给予生理盐水和1600,800uku/kgEFE灌胃,连续30d。实验结束时完整剥除种植瘤并称重;肉眼直接观察种植瘤的肝内播散及腹腔种植情况,计算肝内播散率及腹腔种植率;通过病理切片观察肺转移肿瘤灶的数目;采用RT-PCR及Western blot方法检测移植瘤中FAK(focus adhesion kinase)及β1-整合素蛋白的表达。结果与模型对照组相比,EFE低、高剂量组原位种植瘤瘤重减轻(P<0.05或P<0.01);种植瘤肝内播散率和腹腔种植率降低,其中,EFE高剂量组与模型对照组比较,具有显著性差异(P<0.05);肺转移灶数目明显减少,与模型对照组相比,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。在原位种植瘤和移植瘤中FAK及β1-整合素在mRNA及蛋白水平的表达方面,EFE高、低剂量组的表达均明显下降,与模型对照组比较具有非常显著性差异(P<0.01)。结论EFE具有抗肝癌转移的作用,其机理可能与EFE能够抑制FAK及β1-整合素的表达有关。

蚯蚓纤溶酶新基因EfP-0的电子克隆及其编码区序列RT-PCR验证

利用生物信息学手段,以期获得蚯蚓纤溶酶F-Ⅰ-0组分的基因。根据从粉正蚓(Lumbricusrubellus)中分离的F-Ⅰ-0组分的N端氨基酸序列VVGGSDTTIGQYPHQL,利用DNAMAN软件通过电子克隆方法,从Lumbricidae的dbEST中获得该组分的核酸序列信息,设计特异引物,经过RT-PCR,成功地从赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因,命名为EfP-0。EfP-0基因全长678bp,编码225个氨基酸的成熟肽,属丝氨酸蛋白酶,胰蛋白酶家族,与F-Ⅰ-0组分的氨基酸组成非常接近。BLAST证明,EfP-0与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40%,因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因,GenBank登录号为DQ836917。构建的pMAL-c2x-EfP-0重组质粒,在大肠杆菌TB1中获得融合蛋白MBP-EfP-0的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板溶解活性。

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及抗栓活性研究

目的摸索蚯蚓纤溶酶的分离纯化工艺和研究蚯蚓纤溶酶的抗血栓活性。方法采用分步盐析、透析、凝胶色谱和亲和色谱法分离纯化蚯蚓纤溶酶 ;此酶的体内抗栓活性检测采用动静脉旁路血栓形成抑制实验法。结果分离纯化得到的蚯蚓纤溶酶比活高 ,为 16 0 5IU/mg ;蚯蚓纤溶酶的体内血栓形成抑制效果比尿激酶作用显著。 结论该法分离纯化工艺简单 ,特异性好 ,纯化的纤溶酶比活高 ;

蚯蚓纤溶酶组分的分离纯化和分析

通过以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析 ,从蚯蚓 (大平二号 ,即赤子爱胜蚓 )纯化出的纤溶酶是一组非均一的纤维蛋白水解酶 .经DEAE 纤维素离子交换和制备电泳进一步分离纯化 ,得到 12个单一组分 .这些组分的等电点 (pI)按照它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)图谱上的顺序从 4 0开始依次降低 ;SDS PAGE证明 ,除3、 4外 ,其余组分均只含一种多肽链 ,分子质量在 2 2～ 34ku之间 ;用shiff试剂和酚 硫酸染色 ,显示 1、 2、 6 5和 7是糖蛋白 ,其中 7的糖含量最高 ;以BAEE、ChromozymUK和ChromozymPL为底物测定 ,7的纤溶酶活性最高 .

壳聚糖固定化蚯蚓纤溶酶及其性质

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,用吸附交联法固定蚯蚓纤溶酶,对蚯蚓纤溶酶的固定化条件及固定化酶的各种性质进行了研究,确定了酶固定的最适条件:1 g用pH为6.5的磷酸盐缓冲液浸泡的壳聚糖载体与5 mL体积分数为1%戊二醛在25℃交联8 h,充分洗去戊二醛之后,加入蚯蚓纤溶酶13 U,4℃吸附6 h,充分洗去未交联的游离酶,酶活力回收最高大约为63%,固定化酶的比活为0.082 U/mg.固定化酶,游离酶的最适温度均为50℃,游离酶的最适pH值为8.5,而固定化酶的最适pH值为8.0,固定化酶的热稳定性,pH稳定性均比游离酶有所提高,游离酶、固定化酶都能水解纤维蛋白原和纤维蛋白,固定化酶不再水解BSA.

蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中的克隆与表达

根据蚯蚓纤溶酶最佳组分的N -末端氨基酸序列设计简并引物 ,以蚯蚓cDNA为模板 ,获得该组分蛋白质的部分编码序列 (AF4 32 2 2 4 ,GenBank登陆号 ) .BLAST相似性分析表明 ,该序列与U 2 5 6 43和U2 5 6 48的部分序列相似性达 91% ,根据 5’和 3’末端保守序列设计引物 ,经PCR获得全长cDNA编码序列 .将该序列插入 pTBY - 11质粒 ,转化大肠杆菌 ,表达蛋白以包含体形式存在 .

赤爱胜蚯蚓(Eisenia Foetida Sarigny)纤溶酶的研究Ⅱ药理学作用

对蚯蚓纤溶酶进行了哈白兔体内、体外溶栓、抗凝试验,分别以蛇毒抗栓酶和尿激酶不同剂量组作对照试验,均有显著的溶解血栓功能.另外,蚯蚓纤溶酶溶解天然血块,对纤维蛋白原含量及凝血时间影响的药理学试验,结果证明蚯蚓纤溶酶具有溶栓与抗凝作用.

赤爱胜蚯蚓（EisenibaFoentidaSarigng）纤溶酶的研究──Ⅵ．蚯蚓溶栓酶对家兔血栓溶解及大鼠实验性脑缺血的保护作用研究

本文通过家兔及大鼠的动物实验证明了，蚯蚓溶栓酶不仅具有明显地抑制血栓形成的作用，更具有很强的血栓溶解作用，其作用性质为激酶和溶酶两种功能。同时证明溶栓酶能明显缩小大脑皮层因结扎大脑中动脉后产生的梗塞灶。从而认为：蚯蚓溶栓酶是一种很有效的溶栓药物。

蚯蚓纤溶酶基因P_(239)的原核表达、纯化及活性测定

通过RT PCR方法从蚯蚓 (Lumbricusbimastus)中获得蚯蚓纤溶酶基因 ,命名为P2 3 9,含有 85 2个核苷酸 ,成熟肽编码 2 3 9个氨基酸 ,通过Genbank序列同源性比较 ,与已知的蚯蚓纤溶酶有一定的同源性 ,为首次获得的新基因。随后构建了 pBV2 2 0 /P2 3 9重组质粒 ,在大肠杆菌DH5α中进行原核表达 ,再经亲和层析柱纯化复性 ,其产物经活性测定 ,确定不仅具有激酶作用 ,而且具有直接溶栓活性。

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及临床作用研究进展

蚯蚓纤溶酶是从蚯蚓中分离的一种丝氨酸蛋白水解酶,有抗凝溶血栓、抗癌抗肿瘤、抗炎、神经修复等作用,在临床上是预防和治疗血栓疾病的有效药物。本文对蚯蚓纤溶酶的分离纯化与药理作用加以概述,为临床蚯蚓溶栓药物的研究提供依据。

蚯蚓纤溶酶7#组分基因在甲醇酵母中的克隆与表达

为了使蚯蚓纤溶酶(EFE)最佳活性组分EFE_7#基因在甲醇酵母(Pichiapastoris)中获得表达,构建了表达载体pPIC9K_EFE,通过对电击条件的优化,转化率达到5×103个/μgDNA.为了便于筛选阳性克隆,以该基因的原核表达产物为抗原免疫动物,获得了与天然EFE_7#组分具有相同免疫特异性的抗体.用该抗体为探针对上述转化子进行筛选,得到了上百株阳性重组子.RT_PCR和westernblotting证明,EFE_7#基因在这些重组子中获得了表达,表达产物相对分子质量高于天然产物.

药用蚯蚓纤溶酶的制备及其性质的研究

从爱胜蚓中制备药用纤溶酶，经工厂中试．收率为２．５２～２．７４％；纤溶活性为２４３３３～２６５６０ｍｍ２／ｍｇ；水解酪蛋白活性为５９８～６４０ｍＵ／ｍｇ。制备工艺重复性好，操作简易可行。另报道了该酶的一些生化特性和稳定性的研究结果。

蚯蚓纤溶酶的糖成分分析

以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析制备的蚯蚓纤溶酶是一组糖蛋白。通过苯酚一硫酸法测中性糖，3，5一二硝基水扬酸法测还原糖，硅胶G薄层层析法鉴定糖的种类，结果为：蚯蚓纤溶酶主要含有中性己糖，含量为15％左右，TFMS的去糖处理会使蚯蚓纤溶酶酶活丢失．

蚯蚓纤溶酶活性影响因子的研究

目的 :对提取过程中影响蚯蚓纤溶酶活性的 5种因子进行了分析 ,以提高纤溶酶的提取活性。方法 :分别采用 0 .9%NaCl抽提、10 %蔗糖抽提、75 %酒精抽提出粗酶。酶活测定方法采用尿激酶琼脂糖 纤维蛋白平板法。硒含量的测定方法采用 3,3′ 二氨基联苯胺比色法 ;砷含量的测定方法采用二乙氨基二硫代甲酸银比色法。结果 :饲养在牛粪饵料中的蚯蚓纤溶酶活性比饲养于生活垃圾中的蚯蚓纤溶酶活性更高 ,蚯蚓体内砷的含量与纤溶酶活性呈正相关 ,而蚯蚓体内硒的含量对纤溶酶活性影响不大。在采用 3种不同的蚯蚓纤溶酶的抽提方法中 ,75 %酒精抽提效率最高 ,0 .9%氯化钠次之 ,10 %蔗糖最低 ;在蚯蚓纤溶酶纯化过程中 ,透析比超滤对蚯蚓纤溶酶的活性影响更小一些。结论 :通过将蚯蚓饲养在适宜的饵料中 ,使用合适的提取手段和提纯方法 。