一种蛇毒类凝血酶纯化新方法

目的提供一种蛇毒类凝血酶的新纯化方法。方法蛇毒经预处理后,依次经过苯甲脒琼脂糖凝胶亲和色谱、阳离子交换色谱和疏水色谱后获得蛇毒类凝血酶,分别对活性、分子量及纯度进行检测,并与使用现有专利方法制备的蛇毒类凝血酶进行质量比较。结果新方法制备的蛇毒类凝血酶与现有专利方法相比,分子量无明显差异,但新方法的比活力更高,且纯度更高,同时新方法的工艺稳定性更佳。结论新方法与现有专利方法相比,简化了工艺步骤,缩短了纯化周期,减少了过程环境暴露风险,可获得高纯度类凝血酶,工艺稳定性高,产品质量一致性好,利于临床安全用药。

在大肠杆菌中表达蝮蛇毒类凝血酶基因gloshedobin

将大连蛇岛蝮蛇毒腺中的类凝血酶基因gloshedobin克隆到pET-32a(+)上,构建了T7启动子控制的大肠杆菌表达质粒,并考察了质粒的稳定性. 采用IPTG诱导,以融合蛋白的形式进行表达,得到以包涵体形式存在的类凝血酶. 通过实验对诱导时间、诱导温度及诱导剂浓度进行了优化,并采用正交实验考察了金属离子对表达的影响,结果表明Fe3+, Co2+对类凝血酶的表达有促进作用.

蛇毒类凝血酶的研究进展

目的介绍蛇毒类凝血酶的研究进展,提示医务人员正确使用各种类凝血酶制剂。方法查阅国内外文献进行分析和总结。结果不同蛇种来源的类凝血酶组分、结构、对血液系统的作用都存在不同程度的差异,有些具有促凝作用,有些凝血活性短暂,最终表现为降纤、抗凝作用。结论目前部分蛇毒类凝血酶名称及其制剂名称较为混乱,应用时应对各种类凝血酶制剂加以区别,正确使用。

蛇毒类凝血酶的纯化及鉴定

采用Source 30Q及Phenyl sepharose HP柱层析进行纯化,并用体外MTT实验研究了蛇毒类凝血酶抗肿瘤转移作用。结果得到SDS-PAGE条带均一、分子量为27.6 ku的类凝血酶I11-H2,体外MTT实验证明,I11-H2具有较理想的抗肿瘤转移作用。

蛇毒类凝血酶基因转染人外周血淋巴细胞的研究

目的 探讨大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶 (Gloshedobin ,GSB)基因转染人外周血淋巴细胞而达到溶栓和防栓的效果。方法 应用PCR及PCR重组技术 ,将GSB基因克隆入逆转录病毒载体pLNCX ,以脂质体介导转染人外周血淋巴细胞 ,并借助于IL 2的分泌通路 ,使GSB分泌至胞外。转染后从mRNA、DNA和蛋白质水平检测GSB的表达情况。结果 转染后 2 4h、48h、72h ,mRNA和DNA水平均有外源基因GSB的表达 ;蛋白质SDS PAGE在 30kD左右出现一条带 ;转染上清于 40 5nm波长处测得精氨酸酯酶的OD值为 0 332～ 0 349。结论 GSB基因在人外周血淋巴细胞中表达 ,并分泌至胞外 ,且转染上清具有精氨酸酯酶活性。

蛇毒类凝血酶基因真核表达载体的构建

目的 构建大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin,GSB)基因真核表达载体,试图借助IL-2的分泌通路,使GSB分泌至胞外而达到溶栓和防栓的目的。方法 应用PCR重组技术,将GSB的5’端和3’端分别与IL-2基因的信号肽和poly A尾相连接,将此重组基因克隆入逆转录病毒载体 pLNCX,以脂质体介导转染人外用血淋巴细胞,并以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因检测转染效率、确定DNA和脂质体的比例。转染24h后从mR-NA、DNA和蛋白质水平检测GSB的表达情况。结果 mRNA和DNA水平均有外源基因GSB的表达;SDS-PAGE显示在相对分子质量 30 000左右出现一条带,且转染上清具有精氨酸酯酶活性。结论 构建的真核表达载体可表达具有活性的GSB,为GSB基因治疗血栓的体内研究打下基础。

白唇竹叶青蛇毒类凝血酶基因的克隆和序列分析

通过分析多种已知的毒蛇蛇毒类凝血酶（SVTLEs）基因序列同源性，以保守的N和C末端氨基酸序列设计引物，克隆得到白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）SVTLE基因并分析其序列。以毒腺总RNA为模板进行RT—PCR，纯化并克隆至pMD18-T。结果表明，该酶基因大小为777bp；推测出其相应氨基酸序列含258个氨基酸残基，分子量为28．02kD，pI值为6．07；其3个可能糖基化位点为NDT103～105、NNS121～123和NRT251～253；与其它毒蛇的已知SVTLEs基因比较分析，推测出其含6对二硫键即Cys31—162、Cys50-66、Cys98．256、Cys142—210、Cys174—189和Cys200—225；其催化活性中心氨基酸残基为His65、Asp110和Ser204。分子进化树分析表明，毒蛇SVTLEs一级结构的进化具有一定种属特征，可为蛇的系统分类提供参考。

蛇毒类凝血酶基因在大肠埃希菌中诱导表达及影响因素

将蛇毒类凝血酶基因(TLE)亚克隆到原核表达载体pMAL-p2X上,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达;同时采用不同的OD值、诱导时间I、PTG浓度和诱导温度对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因重组表达质粒pMAL-p2X进行了条件优化。研究发现,不同的诱导时间、IPTG诱导浓度和诱导温度与融合蛋白表达量有很大关系。SDS-PAGE结果显示,当OD值为0.5,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为37℃时,诱导3 h后蛋白表达量最高,超出此范围可使表达量显著减少。在优化诱导条件后,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白量的66%。

蛇毒类凝血酶的研究进展

自1936年Klobusitzki和Konig首次从美洲矛头蝮蛇(Bothrops jararaca)蛇毒中获得部分纯化的类凝血酶以来,迄今已发现三十余种蛇毒中含有类凝血酶组份,并有二十余种先后得到分离和纯化。尤其是近年来,有关蛇毒类凝血酶分子结构及酶学性质的研究取得了很大进展,部分已作为诊断试剂及治疗药物广泛地应用于临床。兹就近年来蛇毒类凝血酶的研究进展作一简要综述。

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的小鼠致畸试验

本实验主要对尖吻蝮蛇类凝血酶进行小鼠致畸试验,目的在于为今后临床药物安全使用提供资料。

长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的纯化及质量检测

长白白眉蝮蛇原毒经DEAE Sepharose FF ,CM Sepharose FF和G Sepharose CL 6B层析后 ,制得长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶精品。该产品经质量检测完全符合卫生部颁发的质量标准 ,该工艺适合于大规模纯化长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶。

一种来自于尖吻蝮蛇毒的新类凝血酶对血液止血机制的研究

目的：研究尖吻蝮蛇蛇毒止血酶Agacutase的止血机制。方法：水蛭素、肝素、苯甲基磺酰氟（PMSF）、钙离子或尿素等分别与Agacutase酶混合,在体外研究它们对酶凝结活性的影响。新西兰白兔静脉注射Agacutase,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标。结果：水蛭素和肝素对该酶没有影响,PMSF和尿素明显抑制酶的凝结活性,而钙离子激活酶凝结活性。静脉注射Agacutase 0.03-0.12 U/kg剂量后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短,给药后2 h药效达高峰,药效持续24 h。与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致,对活化部分凝血活酶时间（APTT）无影响。结论：Agacutase在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白,但不激活凝血因子II和XIII,在伤口部位加速止血。在正常的血管内,不会造成血栓形成。所有实验结果显示,Agacutase是一个有效的潜在止血剂。

基于特征肽的超高效液相色谱-串联质谱法检测矛头蝮蛇蛇毒种属来源及类凝血酶含量

蛇毒血凝酶类药物是以蝮蛇蛇毒为原料制备的止血药,主要活性成分为蛇毒类凝血酶(svTLEs)。不同蛇种来源的svTLEs结构不同,止血机制不同,药理作用也存在差异,因此准确鉴别蛇毒种属来源和svTLEs含量对于保障该类产品的质量至关重要。研究基于蛋白质组学技术,筛选出了具有种属特异性的矛头蝮蛇svTLE特征肽,并建立了基于特征肽的超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测矛头蝮蛇蛇毒种属来源及类凝血酶含量的方法。采用胰蛋白酶对纯化的矛头蝮蛇svTLE进行酶解,利用纳升液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(Nano LC-Q-Exactive-MS)和Proteome Discoverer^(2).2软件分别进行多肽的检测和鉴定,通过BLAST搜索与Uniprot数据库对比分析,筛选出具有种属特异性的矛头蝮蛇svTLEs特征肽“EAYNGLPAK”。针对该特征肽对酶解温度、酶解时间和酶用量等样品前处理方法进行了优化,利用超高效液相色谱-串联质谱,以m/z 481.9>315.2和481.9>485.2作为检测离子对,采用ESI+模式进行了多反应监测(MRM)定性定量分析。结果显示,特征肽在2.5~30 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数(r)大于0.9996,多水平加标回收率范围为95.5%~101.9%,各水平平行测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.1%~3.2%,完全能够满足实际样品检测需求。方法简便快捷,灵敏度高,专属性强,可用于矛头蝮蛇蛇毒种属鉴别及svTLE含量测定,从源头保证血凝酶类产品的质量,并可为其他蛇毒类产品的质量控制提供参考。

新重组蛇毒类凝血酶r-agkihpin-1的抗血栓活性

目的探讨重组agkihpin将来作为抗血栓药物的可能性,为将来把重组agkihpin做成抗血栓药物提供实验依据。方法用肽指纹图谱验证重组agkihpin分子;以天然agkihpin、生理盐水(NS)或肝素为对照,分别用TAME水解、纤维蛋白平板、SDS-PAGE和纤维蛋白原凝集法检测r-agkihpin-1的精氨酸酯酶、纤溶活性、纤维蛋白原溶解和类凝血酶等生物学活性;以NS或粗毒为对照,用剪尾法和皮下注射法检测r-agkihpin-1的出血活性。结果 r-agkihpin-1中38.7%序列、8个肽段与Gen Bank中agkihpin氨基酸序列是一致的。r-agkihpin-1体外水解TAME的比活性为8.74 U/mg。4~16μg/mL剂量r-agkihpin-1可形成纤维蛋白溶圈面积0.50~1.10cm^2,NS组不形成溶圈,差异有统计学意义(P<0.01);16μg/mL剂量r-agkihpin-1可使90%α链和70%γ链分解,而NS组中纤维蛋白原不被消化,差异有统计学意义(P<0.01)。4~16μg/mL剂量r-agkihpin-1可形成凝块体积0.07~0.23 mm^3,高于NS组的0.01 mm^3,差异有统计学意义(P<0.05)。体内4~16 mg/kg体重剂量的r-agkihpin-1形成血栓干重28.01~22.46 mg/kg体重,低于NS组的35.92 mg/kg体重,差异有统计学意义(P<0.01)。上述活性均稍低于相同剂量的天然agkihpin,差异有统计学意义(P<0.05)。剪尾法、皮下注射法显示4~16 mg/kg、4~32 mg/kg体重剂量的r-agkihpin-1在小鼠中出血时间和出血活性分别为1.81~11.32 min和0.00~0.01,显著低于1 mg/kg体重剂量粗毒的30.00 min(P<0.01)和7.85(P<0.01)。结论 r-agkihpin-1就是agkihpin的重组蛋白,r-agkihpin-1将来有望成为一种新的抗血栓药物。

蛇毒类凝血酶安克洛在毕赤酵母中的表达

目的:利用毕赤酵母表达具有生物学活性的蛇毒类凝血酶安克洛。方法:根据已知的天然安克洛的氨基酸序列,结合酵母偏好密码子,设计并合成了安克洛基因序列,将其克隆至表达载体pPIC9中,得到表达质粒pPIC9/Ancrod,电转至毕赤酵母GS115(His-)菌株感受态中,通过表达筛选获得工程菌株。采用5L发酵罐对工程菌进行发酵,表达安克洛。在诱导表达阶段,补加甲醇-山梨醇混合碳源。经疏水柱、肝素亲和柱和阳离子柱三步分离纯化得到重组安克洛,并鉴定其体外生物学活性。结果:重组安克洛表观相对分子质量为43000～48000,其糖基化不均匀,去糖基后蛋白肽链的相对分子质量约29000。重组安克洛被证明具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活力与天然安克洛相近。结论:采用毕赤酵母表达系统表达并获得有生物学活性的重组安克洛,为大规模生产打下了基础。

临床常用蛇毒类凝血酶制剂对凝血指标的影响

目的观察临床常用蛇毒类凝血酶(SVTLE)制剂对凝血指标的影响,为临床判断可能发生的出血风险作出提示。方法选取2017年1—10月空军军医大学附属西京医院泌尿外科患者102例(泌尿外科组)和耳鼻咽喉头颈外科患者80例(耳鼻喉科组)。泌尿外科组患者均为泌尿系统相关疾病术后使用注射用白眉蛇毒血凝酶止血的患者,耳鼻喉科组均为突发性耳聋使用巴曲酶注射液改善微循环的患者。比较泌尿外科组与耳鼻喉科组治疗前后凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fib)、凝血酶时间(TT)、D-二聚体(DD)、纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物(FDP)的变化。结果泌尿外科组注射用白眉蛇毒血凝酶治疗后Fib水平较治疗前降低,FDP水平较治疗前升高(P<0.05)。耳鼻喉科组巴曲酶注射液治疗后Fib水平较治疗前降低,FDP水平较治疗前升高(P<0.05)。结论 SVTLE制剂可对Fib与FDP水平产生影响,应及时检测用药患者的凝血指标,观察其变化,避免因低纤维蛋白血症引起的出血。