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蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化 被引量:2
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作者 杨利军 杨涛 +4 位作者 程牛亮 解军 牛勃 王国亮 杨琦 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期95-98,共4页
研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白... 研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。 展开更多
关键词 蛇毒锯鳞蝰素 大肠杆菌 发酵 纯化
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蛇毒锯鳞蝰素基因Leul4-Lys15-Glu16的定点突变 被引量:1
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作者 李洪超 李雄彪 胡美浩 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 1996年第2期163-168,共6页
本研究的目的是利用蛋白质工程定点突变的方法,在蛇毒锯鳞蝰素基因分子上增加另一个保守序列RGD(14位精氨酸残基,15位甘氨酸残基,16位天冬氨酸残基),以其增加该分子的生物活性,并探讨蛋白质一级结构,空间结构和功能的... 本研究的目的是利用蛋白质工程定点突变的方法,在蛇毒锯鳞蝰素基因分子上增加另一个保守序列RGD(14位精氨酸残基,15位甘氨酸残基,16位天冬氨酸残基),以其增加该分子的生物活性,并探讨蛋白质一级结构,空间结构和功能的关系。在质粒pJC264的基础上,利用PCR定点突变方法,对蛇毒锯鳞蝰素基因Leu14-Lys15-Glu16进行定点突变,使相应的DNA片段变成表达Arg14-Gly15-Asp16的核苷酸顺序,经酶切和DNA测序鉴定正确。CNBr裂解后,用反相HPLC分析,分离制备突变体蛇毒锯鳞蝰素,制备的突变体蛇毒锯鳞蝰素的N-末端10个氨基酸残基与天然蛇毒锯鳞蝰素的相同。在人的富含血小板血浆测活体系中,经10μmol/L的ADP诱导,突变体蛇毒锯鳞蝰素的IC50为3.0×10^(-7)mol/L;重组野生型蛇毒锯鳞蝰素的IC50为4.0×10^(-7)mol/L;天然蛇毒锯鳞蝰素的IC_(50)为2.8×10^(-7)mol/L。此外,就蛇毒锯鳞蝰素中保守序列Arg-Gly-Asp以及其空间构象对蛇毒锯鳞蝰素抑制血小板凝集之间的关系进行了讨论。 展开更多
关键词 蛇类 蛇毒锯鳞蝰素 基因 定点突变
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重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化 被引量:4
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作者 杨利军 杨涛 +4 位作者 解军 张娟 赵志强 罗佳 牛勃 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2006年第1期84-86,共3页
目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4... 目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 蛇毒锯鳞蝰素 大肠杆菌 发酵
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基因重组Echistatin发酵工艺的优化 被引量:2
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作者 杨利军 杨涛 +2 位作者 解军 赵志强 牛勃 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期66-69,共4页
目的:利用基因工程方法对一种蛇毒锯鳞蝰素蛋白的发酵纯化工艺进行优化,以提高目的蛋白的产量和纯度。方法:对工程菌进行发酵培养并诱导表达,研究不同的培养基、不同补料方式、溶解氧浓度、培养和诱导时间对工程菌产量和目的蛋白表达量... 目的:利用基因工程方法对一种蛇毒锯鳞蝰素蛋白的发酵纯化工艺进行优化,以提高目的蛋白的产量和纯度。方法:对工程菌进行发酵培养并诱导表达,研究不同的培养基、不同补料方式、溶解氧浓度、培养和诱导时间对工程菌产量和目的蛋白表达量的影响,利用几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,通过合适温度和pH裂解融合蛋白得到Ecs纯品,并鉴定和检测Ecs活性。结果:经过高密度发酵优化后,菌体湿重可达110g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的40%;亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为68mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。结论:通过发酵和纯化工艺优化,大大提高了目的蛋白产量,为进一步规模化研究和生产奠定了基础。 展开更多
关键词 蛇毒锯鳞蝰素 大肠杆菌 发酵 纯化
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一种小肽的多顺反子串联表达方法 被引量:1
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作者 杨利军 杨涛 +3 位作者 程牛亮 解军 张悦红 牛勃 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期45-47,共3页
目的:构建蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)多顺反子串联多拷贝基因。方法:以pMD18T-Ecs为模板,利用三对引物分别扩增Ecs基因,每个Ecs基因都有独立的起始和终止密码子,然后通过三个Ecs基因之间合适的酶切位点使之串联,再与表达载体pET30a... 目的:构建蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)多顺反子串联多拷贝基因。方法:以pMD18T-Ecs为模板,利用三对引物分别扩增Ecs基因,每个Ecs基因都有独立的起始和终止密码子,然后通过三个Ecs基因之间合适的酶切位点使之串联,再与表达载体pET30a连接后得到三拷贝重组质粒,在三个Ecs基因之间分别有SD序列和SD间隔序列。将质粒转化E.coliBL21(DE3)后IPTG诱导表达,18%SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果。结果:Ecs的表达量占全菌总蛋白的18%,实现了Ecs的串联表达。结论:Ecs多顺反子的串联表达为小分子蛋白的体外制备提供了一种全新的思路和方法。 展开更多
关键词 蛇毒锯鳞蝰素 多顺反子 克隆及表达 大肠杆菌
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