蛇足石杉COBRA基因家族的分子生物信息学及表达分析

为探明蛇足石杉COBRA基因家族成员分子生物信息学特征及组织表达规律,该文基于蛇足石杉的全长转录组数据,通过生物信息学技术对该家族成员(HsCOBRAs)的理化性质、结构域、保守基序、顺式作用元件、基因表达量等进行分析。结果表明:(1)在蛇足石杉全长转录组中共筛选出24个HsCOBRAs家族成员,其中酸性蛋白9个,稳定蛋白11个,疏水性蛋白5个,具有跨膜结构的蛋白7个,具有信号肽的蛋白3个。(2)亚细胞定位在细胞壁、叶绿体、细胞核、细胞膜上。(3)结构分析发现HsCOBRAs有7种结构域和6种保守基序,部分成员具有高度保守的CCVS结构。(4)HsCOBRAs具有CAAT-box、TATA-box等45种顺式作用元件。(5)HsCOBRA2在叶、孢子、茎、芽胞中的表达量均最高。该研究结果可为HsCOBRAs的进一步研究及生物学功能验证等提供理论依据。

基于全长转录组的蛇足石杉ARF基因家族鉴定分析

生长素响应因子(ARF)是介导生长素信号传导并调节多种生物学过程的转录因子家族。为探究蛇足石杉ARF基因家族成员及其在高温和干旱胁迫响应中的作用,该研究利用全长转录组和RNA-seq数据,分析蛇足石杉ARF基因家族成员的系统发育及表达模式,并通过生物信息学分析,对ARF基因家族的理化性质、结构域、保守基序、系统发育、组织表达模式及高温和干旱胁迫下的表达模式进行分析。结果表明:(1)在蛇足石杉全长转录组中共筛选出24个ARF家族成员,均为酸性蛋白且均为亲水蛋白。(2)亚细胞定位预测显示,所有24个HsARF均定位于细胞核。(3)系统发育分析发现,HsARF与被子植物拟南芥和水稻亲缘关系较远,与高等开花植物只有2个共同的ARF祖先。(4)结构域分析发现,除HsARF18/23/24外,大多数HsARF有B3结构域。二级结构分析发现,HsARF蛋白占比最多的为无规卷曲,其次为延伸链和α-螺旋。24个HsARF蛋白中所用的三级结构模型只有4种。(5)RNA-seq分析显示,7个HsARF在所有检测的组织中表达量均较高,10个HsARF在茎中的表达量高于根和叶,而HsARF13和HsARF14在叶中的表达量低于根和茎。(6)HsARF在高温和干旱胁迫下表达量发生显著变化,其中18个HsARF基因不同程度高温胁迫诱导,有7个HsARF基因响应干旱胁迫,其中有3个HsARF基因受干旱诱导,有4个HsARF基因受干旱抑制。该研究结果为蛇足石杉HsARF基因的功能和生物育种提供了理论参考。

蛇足石杉仿野生栽培关键技术分析

为保护蛇足石杉野生资源,促进可持续利用,针对蛇足石杉仿野生栽培相关的适宜温湿度、光照强度、肥料效应和不同居群在当地的生长速度等部分关键技术环节展开初步研究,为后续蛇足石杉仿野生栽培体系的创建提供参考。

DNA-纳米金探针法检测蛇足石杉内生真菌发酵液中石杉碱甲的含量

本研究将DNA、酶和抗体修饰于纳米金颗粒表面制备纳米金探针,建立了DNA-纳米金探针检测石杉碱甲(HupA)的方法。以磁珠作为载体,将石杉碱甲完全抗原(HupA-OVA)标记在磁珠上,采用竞争免疫分析模式,发现HupA浓度在0.008~16 ng/mL范围内,抑制率(I)与HupA浓度的对数值(lg c)呈良好的线性关系,线性方程为I=0.3006 lg c+0.6142,线性相关系数为0.9952,检测限为19.41 pg/mL。应用该方法对蛇足石杉内生真菌发酵液中HupA进行了检测,加标回收率为99.33%~103.73%,相对标准偏差(RSD,n=3)为1.70%~4.67%。该方法灵敏度高、特异性强、操作简单,可用于蛇足石杉内生真菌发酵液中HupA含量的检测。

蛇足石杉碱丙的结构鉴定

目的 研究石杉科植物蛇足石杉Huperziaserrata (Thunb .)Trev .的生物碱成分。方法 采用各种色谱技术进行分离纯化 ,经光谱数据分析鉴定其结构。结果 从蛇足石杉中分离得到一个生物碱单体。结论 该化合物为一具三环结构的新的lycodine型生物碱 ,命名为蛇足石杉碱丙 (huperzinineC)。

蛇足石杉新碱的结构鉴定

目的 研究石杉科植物蛇足石杉Huperziaserrata (Thunb .)Trev .的生物碱成分。方法 用各种色谱技术进行分离纯化 ,经衍生物制备和光谱数据分析鉴定其结构。结果和结论 从蛇足石杉中分离得到一新的faucettimane型生物碱 ,命名为蛇足石杉新碱 (neohuperzinine)。

中国蛇足石杉资源调查与评估

通过对我国蛇足石杉主要分布区35个野外样点和总样方量71300m2的调查,结合国内12个标本馆470余号蛇足石杉馆藏标本及现有文献的研究表明:蛇足石杉的主要分布区位于我国中亚热带和南亚热带所在的地理区域,幅员面积260×104km2,实际分布生境总面积约39×104km2;性喜阴湿,所适应的生态环境为中亚热带常绿阔叶林和南亚热带季风常绿阔叶林及其次生生态系统;野外生物量的调查得到了蛇足石杉在不同的地理区域的生物量分布格局,并由此结合专家系统对直接取样结果和间接推导数据的权重分析及环境参数的评估,初步确定我国蛇足石杉天然生物量为4656.6t;并以此为基础,在进一步考虑人的采集能力的前提下,判定我国蛇足石杉的理论可采量为1604t;同时指出,在目前收购价格条件下(30～40元/kg),我国蛇足石杉商业可采量大约不会超过200t。由于蛇足石杉资源分散,而且许多相对集中的产地均位于自然保护区和风景区范围内,因此,不可大规模开采,解决资源短缺的问题还有赖于寻求其他更加科学合理的途径。另外,论文为小型植物的生物量和可采量评估提供了一些新思路和方法。

HPLC法测定蛇足石杉中石杉碱甲含量

目的 考察蛇足石杉不同产地、不同部位中石杉碱甲 (Hup A)和总碱含量 ;比较不同提取方法对石杉碱甲含量的影响。方法 采用 RP- HPL C法测定 Hup A的含量。结果 Hup A在根、茎、叶中的含量为茎、叶 >根 ;贵州、广东和安徽产地的 Hup A含量分别为 0 .0 18% ,0 .0 2 1% ,0 .0 2 0 % ,提取方法之间差异不显著。结论 Hup A含量在蛇足石杉中的分布为地上部分大于地下部分。不同产地 Hup A含量有一定差异。

一株拮抗真菌的蛇足石杉内生细菌分离鉴定及培养条件优化

从蛇足石杉(Huperzia serrata)叶片中分离到一株对小麦赤霉(Fusarium graminearum)等多种植物病原真菌有强拮抗作用的内生细菌H-6。通过形态和培养特性观察、生理生化实验及16SrDNA序列分析,初步鉴定该菌属于伯克霍尔德属,命名为Burkholderia sp.H-6。同时还对该菌培养条件进行了优化,得出马铃薯浸出液中添加2.5%的甘露醇和0.1%NaNO3有利于细胞生长和抑菌活性的产生,最适培养温度为28℃,最佳初始pH4.0。

草药蛇足石杉的研究进展

对蛇足石杉的药理作用及其临床应用方面的研究作较全面综述 。

蛇足石杉外植体表面消毒及内生菌消除方法

为了获得蛇足石杉的无菌材料,使用双氧水、酒精、升汞等消毒剂对外植体进行表面消毒,使用混合抗菌溶液及不同温度的热水浴处理外植体以消除内生菌.结果表明:茎段经预处理后,用47℃热水浴处理1 h,再经70%酒精处理30 s,0.1%升汞处理7 min后,能达到较好的表面消毒及内生菌消除的效果;孢子囊和茎尖经预处理后,再经过70%酒精处理30 s,0.1%升汞处理4 min即可达到较好的表面消毒效果;消毒剂结合温度处理能降低内生菌的污染率;孢子囊和茎尖几乎不含内生菌,是可用于组织培养的较好的外植体.

浙江及邻近地区蛇足石杉依存环境的初步研究

对浙江及邻近地区产的蛇足石杉(Huperzia serrata)7个种群的自然环境进行野外观察,测定了土壤含水量、电导率、有机质含量、pH值,植株和土壤中K、Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn、Na、Al、Pb、Cd11种元素的含量,以及植株中石杉碱甲(HupA)含量。结果表明,蛇足石杉种群多分布于海拔350-1700m的山地密林下或沟谷阴湿土中,郁闭度、年均降雨量、空气相对湿度均较大;环境中土壤含水量为10%-30%,pH值4.57-5.31,电导率0.061-0.385mscm-1,有机质含量6.18%-9.75%;蛇足石杉对K、Ca、Zn和Na的需要程度较高,对Pb、Cu、Cd3种重金属元素的富集能力较强,在人工栽培中应注意协调各元素的合理配给;蛇足石杉较适宜生长的环境条件为:土壤电导率以及pH值相对较低;郁闭度高,年均降雨量和空气相对湿度较大。基于土壤理化性质,对7个种群分布点进行除趋势对应分析,表明石杉碱甲含量高的磐安种群分布点具有特殊性,提示环境条件对蛇足石杉中HupA含量有较大的影响。

蛇足石杉及其近缘种表征关系的FTIR主成分分析

蛇足石杉是一种重要药用植物,其种内变异程度高,近缘种多,植株体型小,可供鉴别性状少。运用OMNI采样器傅里叶变换红外光谱直接测定法,获得了蛇足石杉(HuperziaSerrata)及其5个近缘种:四川石杉(HuperziaSutchueniana)、闽浙马尾杉(PhlegmariurusMingchegensis)、石松(LycopodiumJaponicum)、深绿卷柏(SelaginellaDoederleinii)和异穗卷柏(SelaginellaHeterostachys)16个叶片样品的红外光谱,以666～3145cm-1范围内吸收峰吸光度为指标,以红外光谱图为对象,应用主成分分析(PrincipalComponentAnaly sis),比较了16个样品在红外光谱上的差异程度。发现基于傅里叶变换红外光谱的主成分分析排序图能够在一定程度上表征16个样品的分类关系。应用FTIR直接测定法能够鉴别蛇足石杉及其近缘物种。

微生物对蛇足石杉扦插生根及若干生理生化指标的影响

目的:研究原生境土壤微生物、内生真菌和根表真菌对蛇足石杉扦插生根率和若干生理生化指标的影响。方法:蛇足石杉分别在原生境土壤(土壤Ⅰ)、接种了内生真菌和根表真菌的灭菌土壤(土壤Ⅱ)、灭菌土壤(土壤Ⅲ)上进行扦插,调查蛇足石杉扦插生根率,测定可溶性蛋白含量,可溶性糖含量,PPO(多酚氧化酶),POD(过氧化物酶)活性、黄酮类化合物和石杉碱甲含量。结果:与土壤Ⅲ上的扦插蛇足石杉相比,土壤Ⅰ和土壤Ⅱ上植株生根率,分别提高了10%和16%,土壤Ⅱ上扦插植株茎中的可溶性蛋白含量显著提高(P<0.05),土壤Ⅰ上扦插植株叶片和茎中的可溶性糖含量显著提高(P<0.05),土壤Ⅰ和土壤Ⅱ上的扦插植株的黄酮类化合物含量显著提高。结论:原生境土壤微生物、内生真菌和根表真菌对扦插蛇足石杉的生根有促进作用,提高蛇足石杉体内的代谢水平。

蛇足石杉扦插及芽胞繁殖研究

目的：针对蛇足石杉Huperzia serrata（Thunb.ex Murray）Trev.野生资源急剧减少,野生种群遭到毁灭性采挖而面临枯竭的现状,利用蛇足石杉带茎尖插条和芽胞进行野外半人工辅助繁殖,以期建立一套稳定、有效的人工繁殖体系。方法：以湘西古丈高望界林场岩陀寨为实验地,采用2年生以上顶技为试材,设计4因素3水平正交试验,研究了插条长度、NAA浓度和插条在NAA溶液中的浸泡时间对扦插生根的影响;通过2年时间的野外定点观测,对蛇足石杉芽胞发生、散落和生长动态进行跟踪研究,并对置于不同土壤层的芽胞萌发进行研究。结果：在原生境中,长6 cm的插条在NAA质量浓度20 mg/L中浸泡5 min的处理为最佳,60 d后即有白色不定根产生,90 d后成活率达90%,210 d后插条有明显生长量;蛇足石杉芽胞大多形成于每年7~9月,次年3~4月成熟后从母株上脱落,遇到适合条件随即萌发生长为幼苗,6个月即可成独立植株;萌发实验表明,光照和湿度是影响芽胞萌发的主要因素。结论：在自然生境中,建立蛇足石杉扦插繁殖体系切实可行;利用芽胞进行人工繁殖可建立稳定有效的幼苗再生体系。该研究对缓解蛇足石杉资源匮乏有重大意义。

蛇足石杉的形态学及不同光照处理下气孔特征的研究

对蛇足石杉的形态学特征进行了重新描述,并对不同光照处理下蛇足石杉叶片的气孔特征进行比较。结果表明:在一定范围内,随着环境中光照强度的增加,气孔长度和宽度、单个气孔面积、气孔密度及气孔总面积都呈增加的趋势。当光照强度超过某一阈值时其气孔指数和气孔密度仍呈增加的趋势,但气孔长度、宽度和单个气孔面积呈变小趋势。小而密的气孔是其适应旱生环境的表现,表明其具有一定的生态适应能力,但进行人工栽培时应避免光照过强。

真菌对蛇足石杉扦插生根的影响及其机理研究

研究了真菌对蛇足石杉插条生根效应的影响,及其生根过程中吲哚乙酸(IAA)、酚类化合物(儿茶酚、槲皮素、绿原酸、阿魏酸)含量、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性的变化。结果表明,真菌能够提高蛇足石杉的生根率,增加生根条数,原因是真菌提高了蛇足石杉扦插生根过程中IAA及儿茶酚、槲皮素、绿原酸等酚类化合物含量。

蛇足石杉生物碱成分的研究(Ⅲ)

从石杉科植物蛇足石杉中分得4个生物碱（Ⅰ～Ⅳ）．经光谱鉴定，分别为去-N-甲基-β-obscurine（Ⅰ），lycopodine（Ⅱ），lycodoline（Ⅲ）和6-α-羟基-lycopodine（Ⅳ）。其中碱Ⅰ和Ⅳ为首次从该植物中分得。

蛇足石杉生物碱成分的研究(Ⅱ)

从石杉科植物蛇足石杉中分离出3个生物碱。经光谱分析鉴定，分别为8－deoxyserratinine（Ⅰ）、lycodine（Ⅱ）和PhlegmariurineB（Ⅲ）。其中Ⅱ和Ⅲ为首次从该植物中分得。

湘西蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量的测定

采用超声萃取法提取湘西蛇足石杉总生物碱,用高效液相色谱法同时测定其石杉碱甲、乙和丙含量,并分析其在植株不同部位的分布。结果表明:湘西4个样地蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量基本一致,分别达到0.5‰、0.3‰和0.04‰;但植株不同部位三种石杉碱含量差异显著,其中石杉碱甲和乙的分布均为叶>茎>根,石杉碱丙则是根大于叶和茎。由此可知,湘西蛇足石杉具有资源优势,石杉碱在植株的分布具有明显的部位选择性;采用HPLC可同时检测石杉碱甲、乙和丙,方法简单快速、准确可靠。