不同破壁方法对细菌蛋氨酸产量的影响

为考察不同破壁方法对细菌蛋氨酸产量的影响,分别采用碱解、溶菌酶、超声波以及碱解与超声波、溶菌酶与超声波之间的复合破壁方法对一株产蛋氨酸细菌进行细胞破壁,并用氯铵-T法分别测定胞外发酵液和各种破壁条件下胞内蛋氨酸的含量。结果表明:发酵液中蛋氨酸为0.952mg/L,经碱破壁、溶菌酶破壁、超声波破壁、碱与超声破复合破壁、溶菌酶与超声波复合破壁后,蛋氨酸总产量分别提高了10.9%、12.0%、18.3%、19.6%、22.2%,上述结果表明细菌细胞破壁后,蛋氨酸产量明显提高,且不同破壁方法提高程度不同,复合破壁方法与单一破壁方法相比,蛋氨酸产量提高效果显著。

大肠杆菌MetJ的基因修饰对其蛋氨酸产量的影响

采用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍基因突变法,得到大肠杆菌K-12的耐蛋氨酸类似物突变体。经过发酵测试,突变菌株获得1 020 mg/L的L-蛋氨酸产量。研究结果表明:L-蛋氨酸生物合成过程中的2个关键酶,即胱硫醚γ-合酶与胱硫醚β-裂解酶,在L-蛋氨酸发酵过程中未受到蛋氨酸的反馈阻遏。采用PCR方法对突变体的MetJ蛋白克隆并进行基因测序可知,野生型的第54位的丝氨酸基因被替换为天冬氨酰,使得反馈阻遏作用消除,从而有效提高L-蛋氨酸的发酵产量。

产L-蛋氨酸基因工程菌株的构建

以野生型蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)EN34为出发菌株,增强胱硫醚γ-合成酶基因(metI)表达,敲除或弱化腺苷蛋氨酸合成酶的编码基因metK,分析这2个基因的改变对蛋氨酸产量的影响。从枯草芽孢杆菌基因组中扩增P43强启动子,连接到pEB03质粒,利用重组连接的方法,将metI从Bacillus cereus EN34扩增重组连接到质粒,构建成pEB03-P43-SD-metI,通过电击转化到Bacillus cereus EN34,获得Bacillus cereus EN34(pEB03-P43-SD-metI)菌株。通过Bacillus cereus EN34扩增metK基因,提取质粒pKVM1以及重组连接等方法,构建出pKVM 1::metK′敲除质粒,将质粒电转化到Bacillus cereus EN34中进行metK交换,再筛选出单交换成功的菌株,最后获得metK弱化成功Bacillus cereus EN34Δ(metK)菌株。经发酵培养基硫源优化分析得出,单独增强metI表达不能提高蛋氨酸产量,产量与出发菌株基本一致;改变metK基因,能提高蛋氨酸产量,但不能完全删除metK基因,否则将导致细胞死亡。硫源采用200μL/L甲基硫醇钠和二甲基硫醚的混合物(体积比19∶1)、15 g/L的Na 2SO 4,二者结合,Bacillus cereus EN34Δ(metK)菌株蛋氨酸产量为440.66 mg/L,是出发菌株的20倍。本研究为芽孢杆菌工程菌的构建了提供一定的技术支持。