落叶松-杨栅锈菌MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白互作关系初探

由落叶松-杨栅锈菌侵染引起的杨树叶锈病严重威胁杨树的健康生长。通过家族鉴定和系统发育分析确定落叶松-杨栅锈菌标准菌株ID 48743为MCM4直系同源基因,命名为MlpMCM4。以夏孢子cDNA为模板,运用RT-PCR技术,同源克隆获得中国菌株MlpMCM4基因CDS片段,称之为MlpMCM4(wh03),长度为2460 bp,编码819个氨基酸。结果表明,比对分析显示目的蛋白具有保守结构域,包括Walker A、Walker B和R-finger基序,以及MCM4类型锌指结构。亚细胞定位预测显示其定位在细胞核区域。利用基于分离泛素系统的酵母双杂交技术和萤火虫荧光素酶互补试验,没有检测到落叶松-杨栅锈菌中国菌株MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白能够相互作用,推断二者相互作用可能需要外源渗透压刺激。

斯里兰卡木薯花叶病毒AC2与拟南芥SGS3蛋白互作研究

木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)对我国和世界木薯生产造成严重威胁和危害,目前尚无有效防治方法且缺乏抗性材料,造成严重经济损失,被认为是最有威胁性的病毒病之一,斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)是引起木薯花叶病的主要病原之一。RNA沉默是植物和动物先天性的一种抗病毒免疫反应机制,寄主转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)是真核生物中一种保守的基因表达调控机制,也是重要的抗病毒免疫机制之一。寄主基因沉默抑制子(suppressor of gene silencing 3,SGS3)是PTGS通路的关键蛋白,在寄主抵御病毒侵染中发挥着关键作用。为抵御宿主这种免疫反应,病毒通常编码病毒沉默抑制子(viral suppressors of RNA silencing,VSRs)来抵御寄主PTGS的病毒防御机制,与寄主蛋白互作是沉默抑制子发挥作用的主要作用机制之一。为探究SLCMV AC2是否通过与AtSGS3互作而抑制寄主PTGS的免疫功能,本研究采用酵母双杂交技术(yeast two hybrid system,Y2H)和双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)分析SLCMV AC2与AtSGS3之间的相互作用。结果表明:SLCMV AC2与AtSGS3蛋白在酵母细胞和植物体内均存在相互作用的关系。亚细胞共定位研究进一步证明SLCMV AC2在与AtSGS3互作后,可与AtSGS3形成siRNA-body的RDR6发生共定位。这些结果表明SLCMV AC2可能通过与siRNA-body互作而影响寄主自身免疫机制,提高病毒致病性,SLCMV AC2与AtSGS3的互作可能是SLCMV侵染木薯导致花叶症状发生的分子基础。该研究结果为后续深入解析SLCMV致病机理提供新的理论依据。

草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

牛HSPA6蛋白特性分析及蛋白互作网络构建

通过构建牛热休克蛋白A6(heat shock protein A6,HSPA6)序列与其他生物的系统进化树,以及运用生物信息学方法分析牛HSPA6蛋白的基本理化性质、亲疏水性等,并结合蛋白互作网络,探究牛HSPA6基因编码蛋白的结构和功能特性。结果显示,牛HSPA6蛋白与羊、长江江豚等哺乳动物的氨基酸序列相似性较高;牛HSPA6蛋白分子质量为70 570.64 u,理论等电点为5.66,为酸性亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽;可能存在11个得分>0.900的磷酸化位点,与N-糖基化激活位点可能位于后端碱基;牛HSPA6蛋白是一种主要由40.38%的α-螺旋和33.65%的无规卷曲组成的二级结构相对稳定的蛋白质,包含N-端核苷酸结合域和C-端多肽结合域两个主要的结构域,主要在细胞质中发挥作用;蛋白质互作网络构建结果显示,牛HSPA6蛋白主要与BAG1、DNAJA4、DNAJB1、DNAJC2等蛋白发生互作,参与腺苷酸交换因子活性、ATP酶调节活性、伴侣绑定等,表明牛HSPA6蛋白在牛机体能量代谢等过程中发挥潜在生物学功能。这些多重生物信息学分析为深入探讨牛HSPA6蛋白对肉品质的影响机制提供了理论依据。

BMP2/SMAD1信号通路在绝经性骨质疏松中的蛋白互作功能

目的通过生物信息学角度挖掘骨形态发生蛋白(BMP)2、Smad同源蛋白(SMAD)1蛋白生信数据,解析BMP2/SMAD1信号通路蛋白互作功能在骨质疏松中发挥的作用及影响。方法基于UniPort数据库进行检索,联合STRING、Ensemble、SWISS-MODEL等数据库,挖掘BMP2、SNAD1理化信息并结合相关文献进行分析。构建BMP2/SMAD1蛋白互作通路等。查询BMP2/SMAD1信号通路在骨质疏松中的表达,利用CNKI、Web of science、万方数据库、Springer、Elsevier SD等数据库检索相关文献。中文检索关键词为“BMP2蛋白、SMDA1蛋白、骨质疏松”,英文检索关键词为“BMP2、SMAD1、Osteoporosis”。排除重复性文献、与主题无关性文献。结果获取BMP2、SMAD1基本信息,绘制分子、生物功能图;构建二元互作蛋白通路图及BMP2/SMAD1信号通路网络图;将糖基化磷脂酰肌醇锚蛋白(RGMB)、血色素沉着(HFE2)、泛素连接酶(SMURF)1、SMURF2、丝裂原活化蛋白激酶分子(MAP3K7)、锌指蛋白(ZNF)521蛋白作为潜在关键位点蛋白进行下一步研究;SMAD家族蛋白作为受体位点在BMP通路中发挥关键作用;丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)间接参与BMP2/SMAD1通路调控成骨分化。结论BMP2/SMAD1信号通路中,位于胞外的BMP2蛋白与细胞膜上受体蛋白BMPR1、BMPR2蛋白结合,通过磷酸化激活胞质中SMAD1/5与SMAD4协同调控核内铁代谢;SMAD6/7抑制SMAD1/5协同调控成骨分化表达。在BMP2/SMAD1信号通路蛋白互作网络中,除同族蛋白外,以RGMB、HFE2、SMURF1、SMURF2、MAP3K7、ZNF521为代表的蛋白参与其中,可作为深入研究对象解析BMP2/SMAD1信号通路。在骨质疏松发生过程中,除BMP2/SMAD1信号通路外,包括但不限于MAPK通路的参与,而MAPK的关键作用还有待深究。

葡萄VvGAI1与VvJAZ9蛋白互作及低温下的表达模式分析

【目的】DELLA蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族,是赤霉素信号转导途径中的重要调控因子,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。克隆欧洲葡萄VvGAI1,并对其进行亚细胞定位、蛋白互作和表达分析,为进一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反应中的调控功能奠定基础。【方法】以酿酒葡萄品种‘霞多丽’叶片为试材,采用同源克隆的方法获得VvGAI1序列。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用DNAMAN及MEGA7.0对VvGAI1蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对并构建系统进化树。通过亚细胞定位确定VvGAI1蛋白在细胞中的表达位置;利用酵母试验验证VvGAI1蛋白的转录激活活性;利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证VvGAI1蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系;利用VvGAI1原核表达蛋白制备anti-VvGAI1兔源多克隆抗体;利用Western Blot技术检测VvGAI1蛋白在低温下的表达情况;通过相对电导率分析外源喷施茉莉酸和赤霉素对葡萄抗寒性的影响。【结果】从‘霞多丽’叶片中克隆得到VvGAI1,其ORF为1773 bp,编码590个氨基酸,位于第1条染色体,含有1个外显子,无内含子。VvGAI1蛋白相对分子质量为64.87 kDa,理论等电点p I为5.31,属于酸性不稳定亲水蛋白。VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS结构域,属于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚类分析显示VvGAI1与拟南芥AtGAI和烟草Nt GAI1亲缘关系较近。亚细胞定位与转录自激活结果显示VvGAI1是一个定位于细胞核中且具有转录激活活性的转录因子。酵母双杂交和双分子荧光互补试验也证实VvGAI1与VvJAZ9具有互作关系。将VvGAI1克隆至原核表达载体构建pET28b-VvGAI1重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21中经16℃、1.0 mmol·L^(-1)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvGAI1-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗体。制备的anti-VvGAI1抗体可以特异性检测‘霞多丽’葡萄中的VvGAI1蛋白。Western Blot结果表明,低温处理下葡萄原生质体中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表达趋势,VvGAI1蛋白响应低温诱导表达。与对照相比,50μmol·L^(-1)茉莉酸甲酯(Me JA)处理可以提高葡萄的抗寒性,50μmol·L^(-1)赤霉素(GA3)处理使葡萄对寒冷变得敏感。【结论】葡萄VvGAI1是一个与VvJAZ9相互作用的转录因子,VvGAI1对低温胁迫有响应,外源茉莉酸能够正调控冷胁迫反应,而赤霉素负调控冷胁迫反应。

7个苹果KNOX转录因子基因克隆、表达和蛋白互作分析

【目的】KNOTTED1likehomeobox(KNOX)蛋白在植物生长发育等多个生物学过程中发挥着重要作用。以紫弘富士为材料,分离了多个苹果(Malusdomestica)KONX基因,研究其结构域、进化分析、组织表达、非生物胁迫响应及其与MdOFP相互作用情况。【方法】使用RT-PCR技术克隆获得7个MdKNOX基因并进行生物信息学分析。利用Array技术检测MdKNOX基因在苹果不同组织中的表达模式。使用RT-qPCR技术检测MdKNOX基因在盐胁迫和渗透胁迫下的表达模式。通过Y2H实验检测了MdKNOX蛋白与MdOFP蛋白的互作情况。【结果】测序结果表明,获得了7个KNOX转录因子cDNA:MdKNOX1、MdKNOX2、MdKNOX5、MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16和Md-KNOX22(GenBank登录号:MG021644~MG021650)。结构域分析表明,获得的7个MdKNOX蛋白序列均含有MEI-NOX、HD和ELK结构域。进化分析表明,MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5属于KNOXⅡ亚组;MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16和MdKNOX22属于KNOXⅠ亚组。启动子顺式作用元件分析结果表明,7个MdKNOX基因启动子上包含多个顺式作用元件。Array分析结果显示,MdKNOX基因具有不同的组织表达模式。实时荧光定量PCR分析结果表明,盐胁迫处理下,MdKNOX13的相对表达水平上调,而MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5的相对表达水平下调;渗透胁迫处理下,MdKNOX2的转录水平下调。酵母双杂交结果显示,MdKNOX1/22蛋白能与MdOFP6蛋白相互作用,MdKNOX5蛋白能与多个MdOFP蛋白相互作用,且MdKNOX5蛋白与MdOFP蛋白相互作用,HD区域是互作必需的。【结论】这些结果为苹果KNOX转录因子在生长、发育和逆境下生物学功能的解析、调控网络的构建提供了强有力的理论基础和参考。

高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1963和92个差异表达基因(DEGs),与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。

二穗短柄草BdGI基因表达及其蛋白互作分析

光周期是调控植物开花的主要途径之一,GI在光周期途径中是控制生理节律和开花的关键因子。为探索二穗短柄草(Brachypodiam distachyon)BdGI基因的表达模式和蛋白互作关系,本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析BdGI基因在不同光照条件下和长日照下不同生长发育阶段的表达情况;运用酵母双杂交初步筛选出互作蛋白BdZTL,并用双分子荧光互补法(BiFC)和免疫共沉淀法(CoImmunoprecipitation)进行验证。qRT-PCR分析结果表明,BdGI基因在不同光照下和长日照下不同生长发育阶段的表达情况不同,且都保持一定的昼夜节律,并且受到光周期的调控;利用酵母双杂交检测到GI与ZTL蛋白存在互作关系,双分子荧光互补与免疫共沉淀检测结果验证了两者互作关系的真实性。综上所述,BdGI的表达受光周期调控,具有昼夜节律性,在光周期诱导二穗短柄草开花的过程中也具备一定的调控作用。本研究结果为GI基因的功能研究奠定了理论基础。

中华绒螯蟹代谢蛋白互作网络构建及分子功能、亚细胞定位和途径分析

为了构建中华绒螯蟹代谢过程研究的系统工具,实验在已经构建的中华绒螯蟹蛋白互作网络的基础上,首先采用邻接节点注释法对未知蛋白的分子功能进行预测。随后采用GO回溯法,构建了代谢蛋白网络并对网络中蛋白分子功能、亚细胞定位和途径分布进行了分析。分子功能注释中,确定了932个蛋白的分子功能,占所有未知分子功能蛋白的97%。最终构建的代谢蛋白互作网络包含2045个蛋白及这些蛋白之间的15927条互作关系。网络中94.2%(1926/2045)的蛋白具有亚细胞定位信息,大多分布于有膜细胞器中;96.1%的蛋白(1966/2045)具有分子功能信息,大多具有催化活性和结合活性。进一步对确定了分子功能和亚细胞定位的蛋白在40个KEGG子系统中的分布进行分析,发现参与翻译和氨基酸代谢过程的蛋白较多,也有一部分参与免疫和运输过程。本实验结果可为中华绒螯蟹代谢相关的蛋白功能、定位的研究提供重要的数据参考,对系统研究中华绒螯蟹代谢过程及代谢相关疾病具有重要价值。

本氏烟组蛋白H4与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染

以番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)外壳蛋白(Coat protein,CP)为研究对象,通过荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay,LCI)研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示,ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中,组蛋白H4定位于细胞核中,两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明,烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术沉默本氏烟烟草中的H4基因,对沉默H4基因的植株接种ToMMV,接种后第4 d,通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量,发现病毒含量显著低于对照组,结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制,组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细胞核内发挥作用,进而使病毒完成系统侵染。

羊口疮病毒129蛋白互作宿主蛋白的筛选与C1QBP基因的克隆分析

【目的】以羊口疮病毒129(ORFV129)蛋白为研究对象,在构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库的基础上,通过酵母双杂交筛选与其相互作用的蛋白。【方法】采用SmartTM技术构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pGBKT7-129,并将其转化至Y2HGold酵母感受态细胞,验证质粒pGBKT7-129是否具有自激活性。对转化了质粒pGBKT7-129的菌液进行生长曲线测定,验证该质粒是否对酵母细胞有毒性作用。以ORFV129为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选出与ORFV129相互作用的宿主胞内蛋白并对阳性菌落进行PCR和测序鉴定。利用DAVID 6.7的GO数据库对胞内宿主蛋白进行功能分类和通路分析,并依据Cytoscape v 3.8.0软件绘制ORFV129与胞内蛋白相互作用的网络图。以山羊脾脏为组织样本,采用RT-PCR技术克隆山羊补体C1q结合蛋白(complement C1q binding protein,C1QBP)基因CDS区序列,并采用在线软件进行生物信息学分析。将C1QBP基因CDS区序列连接至pcDNA3.1(+)构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-C1QBP,并将其转染至山羊鼻甲骨原代细胞进行亚细胞定位分析。【结果】试验成功构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库,文库容量约为6.0×106CFU/mL。成功构建诱饵质粒pGBKT7-129,重组质粒pGBKT7-129无自激活能力且对酵母细胞无毒性。利用酵母双杂交筛选出14个与ORFV129进行互作的胞内蛋白并对阳性克隆进行PCR、测序验证。试验成功克隆山羊C1QBP基因CDS区,长度为837 bp,编码279个氨基酸。系统进化树显示,山羊和绵羊亲缘关系最近。C1QBP蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽结构和跨膜结构域,主要包括3种磷酸化位点,分别是18个丝氨酸、4个苏氨酸和3个酪氨酸位点。C1QBP蛋白二级结构由α-螺旋(33.81%)、无规则卷曲(46.40%)、延伸链(16.91%)和β-转角(2.88%)组成,三级结构与二级结构一致。间接免疫荧光试验表明,C1QBP蛋白散在分布于细胞质中。【结论】筛选出了与ORFV129蛋白相互作用且在天然免疫应答中发挥作用的宿主胞内蛋白C1QBP,通过间接免疫荧光试验验证C1QBP定位于细胞质中,推测ORFV129与能C1QBP相互作用诱导炎症,为进一步验证ORFV129蛋白介导ORFV抑制机体免疫应答的过程奠定基础。

马疱疹病毒1型gD囊膜蛋白互作蛋白的鉴定分析

旨在筛选并分析与马疱疹病毒1型(EHV-1)gD囊膜蛋白相互作用的宿主蛋白。用免疫共沉淀和LCMS/MS质谱技术鉴定出与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,并进行生物信息学分析。免疫共沉淀联合质谱分析鉴定到229个与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,对蛋白功能分析发现大多数蛋白与形成细胞骨架有关,细胞骨架不仅能支撑细胞形态,还参与物质运输,结果提示有部分蛋白参与囊泡运输并在其中发挥重要作用,还存在与囊泡形成直接相关的蛋白——网络蛋白重链,为探究EHV-1二次囊膜化的形成过程和研究gD囊膜蛋白与囊泡间的关系奠定了基础。

苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP(basic-leucine zipper)转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过对MdHY5启动子序列进行预测分析,并结合拟南芥同源基因芯片数据,进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测,并进行蛋白纯化;利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析,在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员,聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高,该基因位于苹果基因组12号染色体上,基因编号为MDP0000586302,与拟南芥AtHY5结构相似,MdHY5也含有4个外显子,3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp,其中5′非编码区长度为214 bp,3′非编码区长度为403 bp,开放阅读框长度为495 bp,编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示,MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构(bZIP domain),其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域(NLS domain)。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达,其中叶片中表达水平最高,花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现,MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件,而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导,而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导,菌体经超声波破碎后显示,融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验,结果显示,MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子,是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因,与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构,在叶中表达量最高,同时对多种光质具有表达响应,能够与MdCOP1互作。

苹果MdJAZ1基因表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果茉莉酸信号途径阻遏因子基因MdJAZ1,并对其表达及蛋白互作进行分析,为进一步研究MdJAZ1的功能奠定基础。【方法】以TIFY及Jas功能域为探针,在苹果基因组中进行比对,获得多个同源基因,对其中的一个基因设计引物进行克隆;利用DNAMan软件对该基因编码蛋白的分子量、等电点进行预测;利用SMART在线分析软件对该蛋白的功能域进行分析;利用MEGA5.0对该蛋白与拟南芥JAZ家族蛋白构建系统发育树;利用荧光定量PCR分析该基因在苹果不同组织器官、茉莉酸甲酯及创伤处理下的表达情况;利用Plant CARE在线软件分析该基因启动子区域的顺式作用元件;利用酵母双杂交系统检测MdJAZ1蛋白的二聚化及其与拟南芥AtCOI1蛋白的互作关系。【结果】MdJAZ1开放阅读框为1 149 bp,编码382个氨基酸残基,其蛋白的分子量为40.536kDa,等电点9。氨基酸序列分析显示,该蛋白包含保守的TIFY及Jas结构域;系统发育树分析显示,MdJAZ1蛋白与拟南芥JAZ家族AtJAZ3、AtJAZ4亲缘关系最近;qPCR结果显示,MdJAZ1在苹果的根、茎、叶、花及果实等组织中都有表达,但表达水平存在明显差异,其中根中的表达量最高,果实中的表达量最低;该基因还能被茉莉酸甲酯及创伤处理诱导表达,均在1 h内达到最高表达水平;启动子分析显示,MdJAZ1启动子中包含多个ABA、乙烯、抗病及逆境胁迫等响应元件,此外,还包含多个MYB结合位点;酵母双杂交结果显示,MdJAZ1蛋白能与其自身相互作用形成同源二聚体,还可与拟南芥中同源性较近的AtJAZ3、AtJAZ4蛋白相互作用形成异源二聚体,并且在冠菌素存在时,MdJAZ1蛋白可与拟南芥F-box蛋白AtCOI1相互作用。【结论】MdJAZ1受茉莉酸甲酯及创伤诱导表达,其蛋白能形成同源及异源二聚体,且在冠菌素存在时可与AtCOI1互作。

2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者炎性因子、氧化应激、硫氧还蛋白互作蛋白水平研究及相关性分析

目的研究2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者炎性因子、氧化应激、硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)水平,并探讨其相关性。方法 102例非酒精性脂肪肝患者分为血糖正常组(空腹血糖<6.1 mmol/L,餐后2 h血糖<7.8 mmol/L)、糖耐量异常组(空腹血糖6.1~6.9 mmol/L,或餐后2 h血糖7.8~11.0 mmol/L)、2型糖尿病组(空腹血糖≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L)。观察3组患者炎性因子[C-反应蛋白(CRP)、白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、脂联素]、氧化应激[还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶T-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)]、TXNIP水平,并对其进行相关性分析。结果糖耐量异常组和2型糖尿病组CRP、IL-6、TNF-α水平均高于血糖正常组,脂联素水平低于血糖正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。2型糖尿病组CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均高于血糖正常组和糖耐量异常组,脂联素水平低于血糖正常组和糖耐量异常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。糖耐量异常组IL-1β水平与血糖正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。糖耐量异常组、2型糖尿病组GSH水平高于血糖正常组,T-SOD、GSH-Px、CAT水平低于血糖正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。2型糖尿病组T-SOD、GSH-Px、CAT水平低于糖耐量异常组,差异均有统计学意义(P<0.05),2组GSH水平比较,差异无统计学意义(P<0.05)。糖耐量异常组、2型糖尿病组TXNIP水平高于血糖正常组,2型糖尿病组TXNIP水平高于糖耐量异常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析表明,TXNIP水平与CRP、IL-6、TNF-α、GSH水平呈正相关,与脂联素、T-SOD、GSH-Px和CAT呈负相关(P<0.05)。以TXNIP为应变量,CRP、IL-6、TNF-α、GSH、脂联素、T-SOD、GSH-Px和CAT为自变量进行多重线性逐步回归分析,结果显示,在排除多种因素相互影响后,TXNIP与CRP、IL-6和TNF-α呈正相关(P<0.05)。结论合并非酒精性脂肪肝糖耐量异常和2型糖尿病患者均有明显的炎性反应,且有氧化应激损伤,TXNIP可能参与了2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的发病过程。

2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者血糖、血脂和硫氧还蛋白互作蛋白水平研究及相关性分析

目的研究2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者血糖、血脂、硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)水平,并探讨其相关性。方法 102例非酒精性脂肪肝患者分为血糖正常组(空腹血糖<6.1 mmol/L,餐后2 h血糖<7.8 mmol/L)、糖耐量异常组(空腹血糖6.1~6.9 mmol/L,或餐后2 h血糖7.8~11.0 mmol/L)、2型糖尿病组(空腹血糖≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L)。观察3组患者血糖(空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白)、空腹胰岛素、血脂[低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)]、TXNIP水平,并对其进行相关性分析。结果糖耐量异常组和2型糖尿病组空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、空腹胰岛素水平均高于血糖正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。2型糖尿病组空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白水平均高于糖耐量异常组,差异有统计学意义(P<0.05),2组空腹胰岛素水平比较,差异无统计学意义(P<0.05)。2型糖尿病组LDL-C、TG、TC水平高于糖耐量异常组和血糖正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。糖耐量异常组TG、TC水平高于血糖正常组,差异有统计学意义(P<0.05),糖耐量异常组LDL-C水平高于血糖正常组,但差异无统计学意义(P>0.05)。3组HDL-C水平比较,差异无统计学意义(0P>0.05)。糖耐量异常组、2型糖尿病组TXNIP水平高于血糖正常组,2型糖尿病组TXNIP水平高于糖耐量异常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析表明,TXNIP水平与空腹血糖、糖化血红蛋白、餐后2 h血糖、空腹胰岛素、LDL-C、TG、TC水平呈正相关(r值分别为0.818、0.875、0.202、0.689、0.849、0.674,P<0.05)。以TXNIP为应变量,空腹血糖、糖化血红蛋白、餐后2 h血糖、空腹胰岛素、LDL-C、HDL-C、TG、TC为自变量进行多重线性逐步回归分析,结果显示,在排除多种因素相互影响后,TXNIP与餐后2 h血糖、LDL-C、空腹血糖呈正相关(P<0.05)。结论合并非酒精性脂肪肝糖耐量异常和2型糖尿病患者均有明显的血糖升高和血脂代谢紊乱,TXNIP与血糖、LDL-C有相关性,可能参与了2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的发病过程。

基于化合物与蛋白互作分析根皮苷的降糖机制

目的:以根皮苷为对象,分析根皮苷在分子层面的降糖机制。方法:通过Stitch和ChEMBL网络数据库检索获得根皮苷的作用靶点及蛋白互作信息,利用分子复合物检测算法(MCODE)对网络进行模块分析及功能注释。结果:从数据库中筛选出21个靶点,构建的蛋白互作网络中有170个节点和545条边,通过聚类分析得到10个功能模板,模块分析表明,根皮苷主要参与组蛋白乙酰化、血糖稳态、乙酰胆碱分解、戊糖降解、嘌呤核苷酸阴离子转运、钙离子稳态等生物过程,发挥降糖作用。结论:本研究从分子网络水平分析了根皮苷的降糖机制,为糖尿病的治疗提供新途径。

基于蛋白互作网络解析甘薯渣中去氢表雄酮的生物作用机制

为探究甘薯渣中主要活性成分之一去氢表雄酮(DHEA)在分子水平上的作用机制,以DHEA为研究对象,通过Stitch和ChEMBL网络数据库检索获得DHEA的作用靶点及蛋白互作信息,利用分子复合物检测算法(MCODE)对网络进行模块分析及功能注释。结果表明:DHEA的作用靶点与各种癌症和神经系统疾病相关,主要参与G蛋白偶联受体蛋白信号通路、碱基切除修复、细胞生物胺代谢和组蛋白甲基化正调控等生物过程。这一研究从分子网络水平解析了DHEA的作用机制,为开展DHEA功能活性研究提供了新的途径。

宿主膜联蛋白A2与伪狂犬病病毒US3蛋白互作及其对细胞凋亡的影响

US3蛋白激酶是伪狂犬病病毒(PRV)的一个重要毒力因子,研究显示US3参与了细胞骨架重排、病毒复制和传播、细胞凋亡和干扰素信号通路等多个生物学过程,鉴定新的和US3互作的宿主蛋白对于认识其生物学功能具有重要意义。本研究首先利用免疫共沉淀和pull-down技术验证了US3和宿主膜联蛋白A2(ANXA2)的相互作用;然后利用RNAi技术,通过荧光定量PCR、病毒滴度测定和免疫印迹分析,发现敲低ANXA2的表达显著抑制了PRV在PK-15细胞上的增殖;进一步发现过表达ANXA2可以抑制PRV或者凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡,提示ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用。本研究进一步完善了可以和US3蛋白互作的宿主蛋白成员,加深了人们对ANXA2生物学功能的理解。