蛋白质免疫印记分析法实验条件的研究

蛋白质免疫印记分析（western blotting）是研究和分析蛋白质的重要手段。该文简述了western blot-ting的方法及实验过程,从实际操作的角度,着重探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。这些从实际工作和预实验中总结出来的优化方法,可以使实验结果更加明晰和易于进一步的分析研究。

黄芩茎叶总黄酮对缺血再灌注损伤大鼠心肌P-STAT蛋白表达的影响

目的观察黄芩茎叶总黄酮(SSTF)对缺血再灌注大鼠心肌信号转导及转录激活因子P-STAT1,P-STAT3蛋白表达的影响。方法 40只SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、缺血再灌注组(IR组)、SSTF 3个剂量组。SSTF组于术前1周灌服不同剂量的SSTF(17.5,35,70 mg·kg-1.d-1),另两组给等量生理盐水。结扎大鼠左冠状动脉前降支方法制备心肌缺血再灌注损伤模型。缺血30 min、再灌注2 h后,采用电镜观察各组大鼠心肌细胞超微结构的变化,Western blot-ting技术检测心肌细胞P-STAT1,P-STAT3蛋白表达的变化。结果与sham组相比,IR组的心肌细胞超微结构损伤明显,P-STAT1蛋白表达增加(P<0.01),P-STAT3蛋白表达减少(P<0.01);与IR组相比,SSTF组细胞超微结构损伤减轻,心肌细胞的P-STAT1蛋白表达减少(P<0.05,P<0.01);P-STAT3蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01)。结论 SSTF可以减轻心肌细胞结构损伤,其机制可能与降低P-STAT1蛋白表达,增加P-STAT3蛋白表达有关。

肺组织特异性X蛋白在非小细胞肺癌中的表达及与肺癌微转移生物作用的关系

目的研究肺组织特异性X蛋白(Lun X)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达,探讨Lun X与NSCLC患者肿瘤微转移的关系。方法收集54例NSCLC患者,转移组(n=34)为NSCLC并肺门纵隔淋巴结转移,非转移组(n=20)为NSCLC无肺门纵隔淋巴结转移患者,另选取同期胸部良性病变行手术患者21例为对照组。采用荧光定量聚合酶链式反应法(FQ-PCR)、蛋白印记法和免疫组织化法检测54例NSCLC患者癌组织、癌旁组织及淋巴结中Lun X基因及蛋白的表达。结果 FQ-PCR结果显示转移组患者癌组织、癌旁组织及癌转移淋巴结中Lun X mRNA表达量均明显高于非转移组(P<0.01);蛋白印记结果显示转移组癌组织及癌转移淋巴结中Lun X蛋白相对表达量较非转移组明显上调(P<0.01);免疫组织化学结果显示转移组癌组织及癌转移淋巴结Lun X蛋白表达量明显高于非转移组(P<0.01),两组癌旁组织在蛋白印迹及免疫组化表达上差异无统计学意义,而对照组肺组织及肺门纵隔淋巴结无Lun X mRNA及蛋白表达。结论 Lun X在NSCLC患者癌组织、癌旁组织及淋巴结中均有表达,其表达的上调可能参与NSCLC患者肿瘤微转移的发生发展过程。

油酸诱导慢性胰腺炎大鼠肝脏细胞GLUT2蛋白表达的改变

目的建立油酸诱导的慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)大鼠模型,观察其肝脏葡萄糖载体2(glucose transporter-2,GLUT2)蛋白表达的改变,探讨慢性胰腺炎继发性糖代谢异常的可能机制。方法用油酸经胰胆管插管灌注的方法诱导CP大鼠模型,对照组大鼠经插管灌注等量生理盐水,Western blot法测定各组大鼠肝细胞GLUT2蛋白表达的改变。结果模型组GLUT2蛋白的表达较对照组都有明显降低(P<0.05)。结论慢性胰腺炎时GLUT2蛋白表达降低,导致胰岛素信号转导异常,这可能是CP继发糖代谢异常的机制之一。

大鼠牙胚发育过程中釉原蛋白含量在空间和时间上的变化

目的 :研究随着大鼠牙胚的发育 ,釉原蛋白 (Am)在空间和时间上的变化。方法 :以重组、纯化的大鼠釉原蛋白为抗原。混入完全 /不完全弗氏佐剂 ,免疫新西兰大白兔 ;用双向免疫扩散法测抗体效价 ,将获得的多克隆抗血清经硫酸胺初步纯化后 ,用Westernblot和免疫组化检测大鼠牙胚Am的组织表达特异性。结果 :Westernblot显示 :在大鼠牙胚组织总蛋白中有特异性表达 ,而在肝、脑、肾组织中没有表达。免疫组化检测 ,在成釉细胞和发育早期的釉基质中有Am的表达 ,而在成牙本质细胞和成熟牙釉质、牙本质中无表达。结论 :釉原蛋白的表达具有严格的空间和时间依赖性 ,在牙胚发育早期高表达而在发育后期和已矿化期表达低或无表达。

禽白血病病毒p27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备

将禽白血病病毒p27基因克隆并构建重组表达质粒pET28a-p27,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导后产生可溶性表达蛋白。表达的蛋白用Western blot进行活性检测,其能与辣根过氧化物酶标记的兔抗p27抗体发生特异性反应;采用金属螯和层析对表达蛋白进行纯化,其纯度约为95%;用纯化的表达蛋白p27免疫家兔制备抗血清,ELISA抗体效价可达1∶25600。研究结果表明,大肠杆菌表达的p27蛋白具有良好的抗原性,可以替代纯化病毒蛋白用于禽白血病病毒检测。

心肌梗塞致心力衰竭大鼠模型心脏NHE-1蛋白表达的改变

目的 观察在结扎冠状动脉前降支心肌梗塞致心力衰竭大鼠缺血心脏Na^+-H^+交换蛋白-1(NHE-1)表达量的变化,探讨NHE-1在心力衰竭中的作用。方法 应用左冠状动脉结扎制备慢性心力衰竭大鼠模型,术后第5周取左心室,分离心肌梗死区和心肌肥厚区,应用Western蛋白印记法检测左室心肌肥厚区NHE-1表达量的变化。结果在左室心肌肥厚区NHE-1表达量较对照组明显升高(P<0.05),且大面积梗塞组光密度值(2.01±0.12)为小面积梗塞组(1.37±0.10)的1.5倍(P<0.05)。结论 NHE-1不但在心肌细胞损害早期和心肌肥大、心室重塑的起始阶段起重要作用,而且在心力衰竭的进程(恶化)中也起重要作用。

油酸诱导慢性胰腺炎大鼠肝脏细胞IR及IRS-1蛋白表达的改变

目的:观察慢性胰腺炎(CP)模型大鼠肝脏胰岛素受体(IR),胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白表达的改变,探讨慢性胰腺炎继发性糖代谢异常的可能机制。方法:将用油酸诱导的CP大鼠作为模型组,同法注入生理盐水的大鼠为对照组,Western blot法测定各组大鼠肝细胞IR,IRS-1蛋白表达的改变。结果:模型组IR,IRS-1蛋白的表达较对照组都有明显降低(P<0.05)。结论:胰岛素信号转导异常可能参与了CP继发糖代谢异常的机制。

对虾白斑综合症病毒核衣壳蛋白VP664的鉴定研究

对虾白斑综合症病毒核衣壳蛋白VP664是至今知道的分子量最大的结构蛋白,全长18 234bp,预计编码6 077个氨基酸.从编码vp664基因的两端各选600bp,分别命名为vp664n、vp664c进行原核表达,成功表达纯化了目的蛋白并制备抗体.蛋白印记杂交(Western blot)实验中蛋白特异抗体只与完整的病毒和核衣壳裂解蛋白中的VP664蛋白反应,而不和膜蛋白反应,证明VP664基因所编码的蛋白在完整病毒颗粒上定位于核衣壳.

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白在大肠杆菌中的高效表达和多克隆抗体的制备

克隆了NS1蛋白基因并构建了重组表达质粒pTIG-Trx-E-tag-NS1。该质粒在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导后获得了大量的可溶性表达蛋白,重组蛋白表达水平达到了细菌总蛋白的42.16%。经Anti-Etag进行Western blotting检测结果为阳性。后经金属螯和层析纯化获得纯度约为95%的蛋白样品,用纯化后的NS1蛋白直接作为抗原免疫家兔产生抗血清,经ELISA检测抗体效价达1∶256 000,通过Western blot检测,与商品化的抗E-tag单抗对照,显示NS1抗体获得了与抗E-tag单抗同样好的特异性。结果证明,成功地制备了特异性的NS1多克隆抗体。

灵芝对肝癌干细胞糖代谢和标志物蛋白的影响

目的:探讨灵芝对人肝癌干细胞糖代谢及标志物CD133蛋白的影响。方法:培养人肝癌SMMC7721细胞并用灵芝L08处理,用MTT法测定细胞的成活率,用试剂盒法测定己糖激酶活性,用Western Blot法测定CD133蛋白的水平。结果:灵芝L08处理人肝癌SMMC7721细胞后,细胞的成活率及己糖激酶活性都有所降低。同时,肝癌干细胞的CD133蛋白水平也降低。结论:灵芝L08能抑制人肝癌细胞的增殖、细胞中己糖激酶的活性和CD133蛋白水平。

小鼠卵母细胞中14-3-3蛋白亚型的表达

目的对小鼠卵母细胞生发泡期(GV)、生发泡破裂期(GVBD)的14-3-3蛋白亚型表达进行鉴定。方法RT-PCR法检测GV、GVBD期卵母细胞中14-3-3蛋白7个亚型的mRNA水平,蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测其蛋白表达水平。结果检测了7个14-3-3亚型(β,γ,ε,σ,ζ,τ和η)mRNA的表达水平,结果显示,在GV期只有14-3-3β和14-3-3ε两个亚型表达,并且14-3-3εmRNA水平显著高于14-3-3β(P<0.01)。在蛋白水平上,在小鼠卵母细胞GV期和GVBD期均检测到14-3-3ε亚型蛋白表达,未检测到14-3-3β蛋白表达。结论 14-3-3蛋白ε亚型在小鼠卵母细胞GV、GVBD期均稳定表达。

Western blot检测家兔动脉组织蛋白质表达条件的优化

蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段,由于其步骤繁杂、影响因素众多,常出现背景噪音高、非特异条带多、拖尾等问题,严重影响后续蛋白质定量分析。为建立最佳的检测家兔动脉组织中蛋白质表达的蛋白质免疫印记技术实验条件,以家兔动脉组织血管细胞粘附分子-1为目标蛋白,从电泳条件、抗体浓度、抗体孵育时间、温度及方法、免疫显色方法等方面进行了改良,成功建立了快速、灵敏、特异的蛋白质免疫印记技术体系;并比较了3种常用的酶免疫显色技术:3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)显色、增强化学发光法(enhanced chemil luminescence,ECL)X光片曝光及ECL化学发光冷却电感耦合成像系统(cooled charged-coupled device,CCD)成像的敏感性。结果表明ECL化学发光法比DAB显色法敏感性高出2～10倍,其中CCD系统敏感性高于X光片4倍,且操作简便,是最理想的检测方法。

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测。结果:Smad2/3/4全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。

MsWRKY33蛋白的抗体制备及对非生物逆境的响应

为在蛋白水平上探索紫花苜蓿MsWRKY33在抗逆性上的生物学功能,以紫花苜蓿品种中苜1号为材料,克隆了MsWRKY33抗原序列并对其性质和功能进行初步分析。对MsWRKY33蛋白的结构和特性进行生物信息学分析表明,MsWRKY33蛋白全长511 aa,主要由无规则卷曲和延伸链结构组成,不具有信号肽,是一个亲水性蛋白,免疫原性预测结果表明该蛋白免疫原性较强。结合序列的特异性选取适宜区段247~457 aa,利用该区段经蛋白纯化、免疫等步骤制备了MsWRKY33多克隆抗体。后续又采用Western Blotting的方法,对4种非生物胁迫(高盐、冷、PEG、ABA)下MsWRKY33蛋白的表达情况进行分析,发现4种胁迫均能诱导MsWRKY33蛋白表达增强,其中盐胁迫的诱导表达丰度最高,表明MsWRKY33在调控植物的高盐逆境响应中可能具有重要作用。试验结果为深入探索紫花苜蓿MsWRKY33基因功能及其对非生物逆境的抗性调控机制提供依据。

hβ-arrestin2基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

目的:构建p EGFP-C1-β-arrestin2融合蛋白表达载体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:以p GEX-5X-1-β-arrestin2为模板,PCR法扩增hβ-arrestin2编码序列,亚克隆至p EGFP-C1中,p EGFP-C1-β-arrestin2经双酶切初步鉴定再送测序公司检测正确后瞬时转染人胚肾细胞HEK293,Western blot检测融合蛋白表达。激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在HEK293细胞中的分布。结果:hβ-arrestin2编码序列被成功克隆至p EGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为77k Da,p EGFP-C1-β-arrestin2定位于HEK293细胞的细胞质中。结论:成功构建hβ-arrestin2基因真核表达载体,证实了融合蛋白定位在HEK293的细胞质中。

链状亚历山大藻组蛋白H3基因克隆与生长过程中的表达分析

链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)是一种典型的产毒赤潮甲藻。甲藻曾被认为没有组蛋白,但近年来在多种甲藻中检测到全部四个核心组蛋白的活跃转录,而目前对甲藻中组蛋白表达模式与具体功能还缺乏深入的研究。本文报道了链状亚历山大藻组蛋白H3变体之一H3.c的全长ORF序列的克隆和分析;分析了链状亚历山大藻生长过程中组蛋白H3在基因和蛋白水平的表达。目前研究发现的链状亚历山大藻H3变体共三个,其中H3.b在N末端序列与其他物种差异最大,为链状亚历山大藻特有的H3变体。对数生长期的组蛋白H3在基因与蛋白水平上均活跃表达,但表达量并不会随着爆发性增长而显著变化,其中H3.b的基因表达在对数末期呈现上调;培养至衰亡期,各H3变体表达均下调,尤其在蛋白水平上呈现明显衰减。结合前期研究,本文认为链状亚历山大藻三个H3均为复制非依赖型(RI)变体,一些变体可响应伴随藻不断生长而逐渐增强的细胞密度等复杂胁迫,推测其参与某些表观遗传修饰,调控生长进程;而衰亡期基于H3的表观遗传调控受到抑制。

Pim-1在结核性胸膜炎和肺癌胸膜组织中的表达及临床意义

目的探讨Pim-1在结核性胸膜炎及在肺癌患者胸膜组织中的表达及临床意义。方法收集我院2021年1月-2021年11月内科胸腔镜手术切除的结核性胸膜炎及肺癌的胸膜活检标本共41例,其中结核性胸膜炎21例,肺癌20例。利用免疫组织化学法和Western-Blot法分别测定胸膜组织中Pim-1蛋白的表达情况,同时探寻与Pim-1表达有关的临床因素。结果Pim-1在结核性胸膜炎组中的阳性率为95.24%(20/21),在肺癌组中的阳性率为70%(12/20),结核性胸膜炎胸膜组织Pim-1表达水平更高(P<0.001);Western-Blot结果显示Pim-1在结核性胸膜炎中表达水平也高于肺癌组(P<0.01);结核组Pim-1蛋白表达与性别、吸烟史、BMI指数均无明显相关性(P>0.05),肺癌组中Pim-1蛋白表达与性别、吸烟史、BMI指数均无明显相关性(P>0.05),可能与淋巴结转移有关(P<0.01)。结论结核性胸膜炎胸膜组织中的Pim-1表达较高,检测胸膜组织中Pim-1对结核性胸膜炎和肺癌有鉴别诊断价值。

新孢子虫和弓形虫ELISA及western blot检测方法的建立及应用

为建立牛新孢子虫和弓形虫的免疫学检测方法,并调查新疆部分地区牛新孢子虫和弓形虫的感染情况,本研究应用纯化的新孢子虫重组蛋白SRS2(NcSRS2)和弓形虫重组蛋白SAG2(TgSAG2)作为包被抗原,分别建立新孢子虫和弓形虫的ELISA和western blot血清学检测方法,并进行特异性和重复性试验,以其检测662份疑似样品,并与商品化试剂盒检测结果比较验证。特异性和重复性试验结果表明,建立的方法特异性强、重复性良好。采用建立的两种ELISA方法对662份临床样品的检测结果表明,新孢子虫和弓形虫的抗体阳性率分别为13.44%(89/662)和5.29%(35/662);与IDEXX试剂盒和永辉试剂盒的符合率分别为94.11%和95.92%。此外,western blot检测的新孢子虫和弓形虫抗体阳性率分别为5.14%(34/662)和3.17%(21/662);与建立的ELISA检测方法的符合率分别为91.69%和97.89%。本研究为分析奶牛流产的原因提供了一定的依据。

灯盏花素抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡

目的:观察灯盏花素(breviscapine,bre)对大鼠心肌缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡的影响并探讨其机制。方法:采用结扎大鼠左冠状动脉前降支方法制备心肌缺血再灌注模型。40只SD大鼠随机分为正常对照组(control)、缺血再灌注组(ischemiareperfusion,IR)和灯盏花素组。灯盏花素组大鼠于术前1周分别腹腔注射不同剂量的灯盏花素(25、50 mg.kg-1.d-1),另2组给予等量生理盐水。缺血30min、再灌注2h后,采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况,western blotting检测Caspase-3蛋白表达的变化。结果:缺血再灌注组凋亡指数和Caspase-3蛋白表达较正常对照组明显升高(P<0.01),灯盏花素组各指标较缺血再灌注组降低(P<0.05,P<0.01)。结论:灯盏花素对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制与通过下调Caspase-3基因表达抑制心肌缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡有关。