Western blot检测家兔动脉组织蛋白质表达条件的优化

蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段,由于其步骤繁杂、影响因素众多,常出现背景噪音高、非特异条带多、拖尾等问题,严重影响后续蛋白质定量分析。为建立最佳的检测家兔动脉组织中蛋白质表达的蛋白质免疫印记技术实验条件,以家兔动脉组织血管细胞粘附分子-1为目标蛋白,从电泳条件、抗体浓度、抗体孵育时间、温度及方法、免疫显色方法等方面进行了改良,成功建立了快速、灵敏、特异的蛋白质免疫印记技术体系;并比较了3种常用的酶免疫显色技术:3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)显色、增强化学发光法(enhanced chemil luminescence,ECL)X光片曝光及ECL化学发光冷却电感耦合成像系统(cooled charged-coupled device,CCD)成像的敏感性。结果表明ECL化学发光法比DAB显色法敏感性高出2～10倍,其中CCD系统敏感性高于X光片4倍,且操作简便,是最理想的检测方法。

ERK1/2介导的bFGF在乳腺癌细胞系MCF-7增殖中的作用

目的观察Ras-Raf-ERK1/2途径介导的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对乳腺癌细胞系MCF-7细胞增殖的影响,探讨bFGF及其信号传导途径与乳腺癌发生及发展的关系。方法应用细胞免疫组织化学技术检测不同浓度bFGF处理细胞后ERK1/2蛋白的表达;应用蛋白印迹技术检测不同浓度、不同时间bFGF和bFGF+PD98059处理MCF-7细胞后,细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白表达水平的变化。结果经bFGF不同浓度(0、12.5、25及50ng/mL)处理MCF-7乳腺癌细胞系后,ERK蛋白表达随着浓度的增加而增强,且与bFGF水平呈剂量依赖关系;以最佳工作浓度25ng/mLbFGF处理MCF-7乳腺癌细胞系不同时间后,其表达活性明显高于对照组和bFGF+PD98059组。加入bFGF抑制剂PD98059后,bFGF诱导MCF-7细胞系p-ERK1/2活性的作用受到抑制,ERK蛋白表达明显下调。结论 bFGF通过Ras-Raf-ERK1/2途径的介导,促进了MCF-7细胞的增殖,进而抵抗无血清诱导的凋亡。抑制剂PD98059可阻断此诱导作用,使ERK表达明显下调。ERK信号传导通路可能是乳腺癌侵袭和转移的重要途径,ERK1/2和bFGF的表达可为乳腺癌治疗的靶点提供理论依据。

bFGF不能调节人结膜下Tenon’s囊成纤维细胞表型改变

探讨了碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)能否对人结膜下Tenon’s囊成纤维细胞(humansubconjunctivalTenon’scapsulefibroblast,HTCF)表型改变起诱导作用。在5例白内障手术中取人结膜下Tenon’s囊组织块培养成纤维细胞。用不同浓度bFGF(0、5、10、20ng/ml)诱导HTCF48h。免疫细胞化学技术、蛋白质印记免疫技术检测其平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)表达与正常HTCF有否差异。实验结果表明用不同浓度(0￣20ng/ml)bFGF诱导HTCF48h,虽能明显促进HTCF细胞的生长,但均不能上调细胞内α-SMA的表达。在0￣20ng/ml范围内,体外用bFGF诱导HTCF48h,不能诱导其改变为肌成纤维细胞。