同位素标记结合免疫印迹-化学发光法鉴定小鼠神经元磷酸化蛋白质组

创建一套简单、实用、灵敏、高效的分析鉴定磷酸化蛋白质组的优化方案。采用同位素标记、双向电泳、放射自显影等技术建立小鼠神经元磷酸化蛋白质组图谱,再用免疫印迹-持久性化学发光技术选择性地鉴定三种小鼠神经元磷酸化蛋白质——PI3Kr3、MEK1、PKCα。结果显示三种磷酸化蛋白质在双向电泳放射自显影图谱和双向电泳免疫印迹-化学发光图谱上的斑点基本匹配,提示本研究建立的以同位素标记和免疫印迹-化学发光法为核心的分析鉴定磷酸化蛋白质组的一整套优化方案灵敏度高、特异性强。

化学发光自显影免疫印迹法(Western Blotting)检测绒山羊皮肤组织中催乳素受体蛋白

采集不同季节绒山羊皮肤组织样品,提取总蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,将电泳结果转移到醋酸纤维薄膜,然后与催乳素抗体结合、辣根过氧化物酶标记二抗结合,后者作用于化学发光底物,暗室中置X-光胶片上自显影数分钟,经显影、定影,得到黑色曝光斑,根据胶片上曝光斑的位置确定出催乳素受体的分子量为87kD。根据不同时期样品黑斑的大小得出各时期催乳素受体表达量与绒毛生长趋势是一致的。

鲁米诺-H_2O_2体系流动注射-化学发光增强法测定胰蛋白酶

在碱性条件下,胰蛋白酶对鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光体系具有显著的增强作用,据此建立了流动注射-化学发光增强法测定胰蛋白酶的新方法.该法简单、快速、线性范围宽,在优化的实验条件下,测定胰蛋白酶在1.0～50.0mgL/的浓度范围内相对发光强度与其浓度呈良好的线性关系,检出限可达0.26mg/L,对浓度为10.0mg/L的胰蛋白酶进行平行测定其相对标准偏差(RSD)为0.7%(n=11),成功地用于合成样品中胰蛋白酶的测定,回收率在90.1%～104.1%,结果令人满意。

超敏化学发光液稀释法降低蛋白印迹的发光强度

蛋白印迹(western blot)分析是根据抗原、抗体特异性结合的原理检测复杂样品中某蛋白的技术。然而当样品中的蛋白浓度过低,特别是目标蛋白为低丰度蛋白时,采用普通化学发光检测,有时出现蛋白条带发光弱,曝光不够,而采用超敏化学发光检测则出现蛋白条带发光强,曝光过度,两者的蛋白条带显影图像均不理想。本文将超敏化学发光液稀释后再检测,显影效果显著提高,蛋白条带图像清晰,可见超敏化学发光液稀释法降低蛋白印迹的发光强度,提高了蛋白条带的显影效果。

4-（1H-三氮唑）苯酚增强化学发光酶联免疫分析法检测甲胎蛋白

增强化学发光酶联免疫分析法除具有化学发光信号持续稳定时间长、发光强度高、灵敏度高等优点外，而且简便、快速、安全、应用面广，克服了直接化学发光用于免疫分析的缺点，提高了化学发光免疫分析的灵敏度。实验利用Luminol—H2O2-辣根过氧化物酶（HRP）-4-（1H-三氮唑）苯酚（TRP）增强化学发光分析体系，采用双抗体夹心法，结合免疫磁性微球分离技术和化学发光分析技术建立了血清中AFP含量的测定方法，实验方法如图1所示。

化学发光技术在蛋白质组学研究中的应用

目的:探讨在蛋白质组学研究中应用化学发光技术分析鉴定蛋白质的方法和价值。方法:采用细胞培养、双向电泳及银染等技术建立小鼠神经元蛋白质组图谱,再用PDQuest 2D分析软件和免疫印迹持久性化学发光技术选择性地鉴定三种小鼠神经元蛋白质-PI3Kr3、MEK1、PKCα。结果:三种蛋白质的双向电泳化学发光图谱上均只出现了1个特异蛋白质斑点,信号强,背景低。结论:利用化学发光技术鉴定蛋白质简单、实用、灵敏、高效,可为蛋白质组学的研究提供有力的技术支持。

基于分子印迹识别的化学发光传感器测定人血清中的游离羟脯氨酸

羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需氨基酸，主要存在于胶原组织中，是构成胶原的重要成分之一，作为胶原蛋白中的特异性氨基酸，可以反映机体中胶原蛋白含量的变化，而胶原蛋白含量变化又与许多疾病有关，如烧伤、创伤后的修复、骨质疏松、肝硬化、肺纤维化、肾纤维化、肿瘤等，因此测定血液中游离羟脯氨酸含量有重要临床意义。

应用ROC曲线分析确定化学发光微粒子法检测TP-Ab灰区

目的确定化学发光微粒子法(CMIA)测定反应性梅毒血清的灰区范围。方法以梅毒螺旋体蛋白免疫印迹试验(TPWB)作为参考方法,对649份CMIA测定值S/CO在1~60的标本,应用ROC曲线确定S/CO的最佳临界点。结果CMIA测定梅毒抗体的灰区范围为1.000~6.815,S/CO为6.815时,敏感度为0.800,特异度为0.865。结论CMIA测定梅毒抗体值为1.000~6.815时,与确证试验TPWB结果不一致时,建议加做TPWB进行复查,以减少假阳性。

生物大分子的化学发光成像研究

本文介绍了三种化学发光成像法在人血清结合珠蛋白分型电泳的快速检测方面的应用。这三种方法都是基于鲁米诺 -过氧化氢发光体系。使用免疫化学发光成像法 ,直接化学发光成像法和增强化学发光成像法 ,能够提高对结合珠蛋白检测的灵敏度 ,获得更宽的线性范围。我们使用这三种方法完成了对结合珠蛋白的快速、高灵敏、高选择性的检测。

化学发光法检测人类免疫缺陷病毒抗体高值阴性样本的分析

目的分析化学发光法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)检测人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)抗体高值阴性样本是否有潜在危险性。方法用CLIA试剂在临床标本中筛选出HIV抗体0.3<S/CO(absorbance signal of sample/cut off value)<0.9的血清样本,用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)复查,将ELISA法阳性反应标本用蛋白印迹(Westernblot,WB)确证并分析结果。结果用CLIA试剂从64 425份临床标本中筛查出CLIA检测HIV抗体0.3<S/CO<0.9的血清样本134例。其中ELISA试剂有阳性反应的标本2例,且此2例患者4周后复查均为阴性。结论 CLIA检测HIV抗体0.3<S/CO<0.9的样本可直接发放阴性结果,无潜在危险性。

生物及化学发光分析进展与医学应用

生物及化学发光分析的灵敏度、特异性可与同位素标记相媲美,且操作简便、快速而又无放射性污染。目前医学上主要应用于:(1)吞噬细胞功能测定;(2)ATP 发光分析用于肿瘤化疗药物敏感性测定、快速微生物计数以及细胞状态估计等;(3)报告基因研究;(4)增强发光酶免疫分析检测白细胞介素1受体拮抗物(IL-1ra)等;(5)探针试验检测人巨细胞病毒 DNA;(6)免疫印迹试验检测载脂蛋白 A 同形体等。并介绍德国EG&G Berthold 公司几种发光仪及美国 Sanofi Diagnostics 巴斯德公司的Access 免疫测定系统。

磷酸化钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在大鼠脊髓背角C-纤维诱发电位长时程增强的诱导和维持中的作用

实验旨在探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin—dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)在脊髓背角C-纤维诱发电位长时程增强(long-term potentiation,LTP)的诱导和维持中的作用。用Western blot技术分别检测LTP形成30 min和3 h脊髓背角(L4-L6)CaMK Ⅱ的含量及其磷酸化水平。同时观察脊髓局部给予CaMK Ⅱ选择性抑制剂KN-93后对脊髓背角LTP和CaMK Ⅱ磷酸化的影响。观察结果如下:(1)诱导LTP后30 min.CaMK Ⅱ的磷酸化水平明显高于对照组,而CaMKⅡ的总量无变化;诱导LTP后3 h CaMK Ⅱ的磷酸化水平进一步升高,而且CaMK Ⅱ的总量也明显增加(n=4);(2)强直刺激前30 min 于脊髓局部给予CaMK Ⅱ的特异性抑制剂KN-93(100μmol/L),可阻断LTP的诱导,同时明显抑制CaMK Ⅱ的磷酸化水平;(3)诱导LTP后30 min给予KN-93,可显著抑制LTP的维持,同时CaMKⅡ的磷酸化水平与未用药组相比也明显降低(n=3);(4)LTP 3 h后给予KN-93,LTP的幅值不受影响,磷酸化的CaMKⅡ的含量与用药前相比也无差别(n=3)。根据上述实验结果可以认为,CaMK Ⅱ的激活参与脊髓背角C-纤维诱发电位LTP的诱导和早期维持过程。

胰岛素增强子结合蛋白1在小鼠胚胎心的时空分布

目的观察转录因子胰岛素增强子结合蛋白1（ISL1）在小鼠胚胎心的表达与心、第二生心区及前肠内胚层的发育。方法胚龄8~13d小鼠胚胎心共18个,连续石蜡切片,用抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗ISL1、抗增殖细胞核抗原（PCNA）和抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体进行免疫组织化学染色、免疫荧光染色和Western blotting检测。结果胚龄9d,ISL1阳性心前体细胞进入流出道远端。胚龄10d,ISL1阳性细胞延伸入流出道近端及静脉窦心肌。胚龄11~12d,心内ISL1表达量逐渐增多并达高峰,动脉端ISL1阳性细胞分布于流出道远端壁、心包内主肺动脉壁及主肺动脉隔,静脉端ISL1阳性细胞主要限于窦房结和静脉瓣。动脉端前肠内胚层细胞索增至最长,周围前生心区ISL1阳性细胞密度也达高峰,并且明显多于后生心区。胚龄13d,心内及第二生心区ISL1阳性细胞显著减少,内胚层细胞索趋于消失。结论 ISL1阳性细胞在小鼠胚胎心的表达主要集中在胚龄9~13d,其表达模式与第二生心区及前肠内胚层的发育密切相关。

磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白_1在糖尿病大鼠肾小球中表达增强

目的探讨磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白1(P CREB1)在糖尿病大鼠肾组织中的表达特征及与细胞外基质积聚的关系。方法雄性Wistar大鼠切除右肾2周后随机分为对照组和糖尿病组,用链脲佐菌素复制糖尿病模型。分别于1、2、4、8和12周用免疫组化检测纤维黏连蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)及P CREB1的表达,Western印迹和RT PCR检测肾皮质CREB1磷酸化(活性)及mRNA的表达。结果糖尿病组FN与LN在4周时开始升高,并持续到12周。CREB1的活性及其mRNA在2、4和8周增高,在12周时降至正常。结论CREB1可能在糖尿病肾病细胞外基质积聚中发挥一定作用。

蛋白酶体抑制剂MG-132增强4-羟苯基维胺脂诱导的肺癌细胞凋亡

[目的]观察4-羟苯基维胺脂(4-HPR)联合应用蛋白酶体抑制剂MG-132对肺癌A549细胞凋亡的影响.[方法]用倒置显微镜和TUNEL染色观察4-HPR或(和)MG-132联合应用后A549细胞形态学变化及对细胞生长的抑制作用;免疫印迹法检测核转录因子-κB(NF-κB)的表达.[结果]不同给药组细胞数量明显变少,失去正常的生长,细胞密度低,光泽度下降,肿胀变形,变圆;4-HPR加MG-132组细胞凋亡率明显升高,MG-132明显增强4-HPR诱导的A549细胞凋亡;免疫印迹观察显示,MG-132降低4-HPR诱导的NF-κB的表达.[结论]MG-132是通过降低NF-κB的表达而增强4-HPR诱导的A549细胞凋亡.

急性白血病的增强剂结合蛋白E12/E47基因位于t(1;19)断裂点

为一种具有免疫球蛋白增强剂结合因子E12/E47性质的蛋白质编码的基因(E2A)被描绘在染色体区19p13.2 p13.3——这是一个与急性淋巴母细胞性白血病的非随机易位相关的部位。携带所研究的白血病及细胞系的大多数t(1;19)(q23;p13)含有由DNA印迹法分析所确定的重新排列的E2A。

Western blot检测家兔动脉组织蛋白质表达条件的优化

蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段,由于其步骤繁杂、影响因素众多,常出现背景噪音高、非特异条带多、拖尾等问题,严重影响后续蛋白质定量分析。为建立最佳的检测家兔动脉组织中蛋白质表达的蛋白质免疫印记技术实验条件,以家兔动脉组织血管细胞粘附分子-1为目标蛋白,从电泳条件、抗体浓度、抗体孵育时间、温度及方法、免疫显色方法等方面进行了改良,成功建立了快速、灵敏、特异的蛋白质免疫印记技术体系;并比较了3种常用的酶免疫显色技术:3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)显色、增强化学发光法(enhanced chemil luminescence,ECL)X光片曝光及ECL化学发光冷却电感耦合成像系统(cooled charged-coupled device,CCD)成像的敏感性。结果表明ECL化学发光法比DAB显色法敏感性高出2～10倍,其中CCD系统敏感性高于X光片4倍,且操作简便,是最理想的检测方法。

三种方法测定肌钙蛋白Ⅰ分析性能的比较与评价

用化学发光法、胶体金法及胶乳增强免疫比浊法测定60例肌钙蛋白I(cTnI),评价三种方法的分析性能及测定结果的差异及相关性,以便临床根据需要选择合适的方法测定cTnI。通过本次评价发现,胶体金法及化学发光法与临床诊断有很好的总符合率,且灵敏度、特异性较高,误诊率和漏诊率低。三种检测方法测定结果之间有显著性差异,P<0.001,两两比较,胶乳法与胶体金法、化学发光法之间有显著性差异,P值均<0.001;胶体金和化学发光法之间没有显著性差异,P=0.986。胶体金法(Y1)与化学发光法(X)相关性好,Y1=1.20X-0.11,R2=0.933;相关性优于胶乳增强免疫比浊法(Y2),Y2=3.65X+0.49,R2=0.892。在分析性能上胶体金法测定cTnI优于胶乳增强免疫比浊法,且与化学发光法有较好的相关性,适用于急诊及床旁检测。