间接ELISA检测非洲猪瘟病毒P22蛋白原核表达方法建立

非洲猪瘟(ASF)是由属于Asfaviridae家族的非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的。本文主要研究间接ELISA(酶联免疫吸附测定)检测ASFV(非洲猪瘟病毒)P22蛋白原核表达方法建立,并得出了一定的实验成果,本研究中开发的基于重组p22∆TM/p30的间接ELISA显示出高重复性,具有可接受的诊断敏感性和特异性。值得注意的是,这种间接ELISA可以检测针对毒性基因Ⅱ型ASFV的抗体,而其他可用的试剂盒则不能。这些特征对于在毒力基因型II型ASFV流行的地区应用此类测试很有用。

草莓FaMRLK47蛋白原核表达条件优化

【目的】优化草莓FaMRLK47蛋白原核表达条件并在研究中应用。【方法】以八倍体草莓‘红颜’(Fragaria×ananassa Duch.‘Benihoppe’)为试材,对比研究异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)在0.5mmol/L和1mmol/L处理,对比分析0、2、4、6、8、12h等不同时间FaMRLK47蛋白诱导表达效率和产量。【结果】IPTG在1mmol/L下诱导8h,FaMRLK47蛋白的表达效率和产量高。【结论】优化草莓FaMRLK47原核诱导表达体系并检测FaMRLK47与寡糖的特异性结合。

GST-Jab1融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的获取GST-Jab1蛋白,进一步研究Jab1的功能。方法以pMSCVneo-Jab1为模板,PCR扩增Jab1 DNA片断,EcoRI和XhoI双酶切后克隆至pGEX-5X-1表达载体,测序验证。将正确重组的pGEX-5X-1-Jab1表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导后,超声破碎细胞,用GST琼脂糖珠对上述表达产物进行纯化,SDS-PAGE、Western Blot分析和鉴定诱导表达和纯化的GST-Jab1蛋白质。结果成功构建了pGEX-5X-1-Jab1重组表达载体,SDS-PAGE分析结果显示表达和纯化的蛋白质与融合蛋白GST-Jab1预期分子量一致,Western Blot鉴定结果证实纯化的蛋白质为GST-Jab1。结论成功地表达、纯化了GST-Jab1融合蛋白。

山羊IL-2的体外表达及其多克隆抗血清的制备

应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊白细胞介素-2(Caprine interleukin-2,CapIL-2)基因并进行测序,将编码山羊IL-2蛋白的基因亚克隆至pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG于37℃诱导培养。表达融合蛋白通过ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化。纯化产物经3次免疫新西兰白兔,制备出山羊IL-2抗血清。本次试验成功地表达、纯化了山羊IL-2,并制备出兔抗山羊IL-2抗血清,为下一步开展山羊IL-2重组蛋白的应用研究奠定了基础。

山羊IL-2基因的克隆、表达及其多克隆抗血清的制备

应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)基因并测序,将编码山羊白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pET30a(+)上,构建重组质粒并进行确证性测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE分析显示,表达的山羊IL-2融合蛋白分子量约为18kD。包涵体被6mol/L盐酸胍裂解后,通过ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化。用所获得的重组山羊IL-2纯化产物经3次肌内注射新西兰白兔,制备了兔抗山羊IL-2多克隆血清,并用Western blot进行了证明。本次试验成功地表达、纯化了山羊IL-2融合蛋白,并制备了抗山羊IL-2多克隆抗血清,为下一阶段关于山羊IL-2重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。

甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)的CUB1、CUB2片段多克隆抗体的制备及鉴定

目的原核表达甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)的CUB1、CUB2功能区蛋白,制备其功能区蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。方法利用带有CUB1、CUB2基因片段的p GEX-6P-2原核载体诱导表达GST-CUB1和GST-CUB2融合蛋白并进行纯化,将纯化后的融合蛋白作为抗原,与Freund佐剂充分混合后免疫5周龄BALB/c雌性小鼠,制备多克隆抗体;应用Western blot法检测多克隆抗体特异性,应用ELISA检测多克隆抗体效价。结果成功表达并纯化GST-CUB1和GST-CUB2蛋白;应用其作为抗原对小鼠进行免疫后,成功制备出与其相应的多克隆抗体,且特异性强,与其他蛋白无交叉反应;间接ELISA测得CUB1抗体效价大于1∶32 000,CUB2抗体效价大于1∶16 000。结论成功制备了特异性强,效价高的GST-CUB1和GST-CUB2蛋白多克隆抗体。

2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA的原核表达及纯化

目的利用原核表达系统制备2型猪链球菌细胞分裂起始因子DivIVA重组蛋白并进行纯化,为研究其在调控细胞分裂中的作用奠定基础。方法以2型猪链球菌05ZYH33全基因组为模板,PCR扩增divIVA基因片段,经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后将目的片段连接至表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a-divIVA,经测序鉴定后将重组质粒转化进入表达菌E.coli BL21,以终浓度为0.1mmol/L的IPTG于37℃培养4h,诱导DivIVA蛋白表达。用Ni离子亲和层析柱分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。结果成功构建重组表达质粒pET28a-divIVA,并在E.coli BL21中表达主要以包涵体形式存在的DivIVA蛋白。包涵体蛋白经8mol/L脲变性溶解后经Ni离子亲和层析柱纯化,获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测分子质量为36ku,与预期大小相符;经Western blot检测,该蛋白能被相应抗体特异性识别。结论在E.coli BL21中成功表达并纯化了DivIVA蛋白,为研究该蛋白在2型猪链球菌的细胞分裂机制奠定了基础。

肠炎沙门菌效应蛋白AvrA的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)avr A基因功能及其在感染过程中的表达分布情况,本研究通过PCR技术克隆获得了avr A基因,并构建了肠炎沙门菌Avr A原核表达载体p Cold-avr A,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;表达蛋白经纯化后免疫小鼠获得Avr A多克隆抗体,通过Western-blot检测了抗体特异性。结果显示,成功构建了表达载体p Cold-avr A,并获得了纯化的Avr A蛋白,成功制备了小鼠抗Avr A蛋白的多克隆抗体,可用于检测细菌Avr A蛋白的表达。本研究成功获得纯化的Avr A蛋白及其多克隆抗体,为进一步探讨Avr A在肠炎沙门菌感染过程中所发挥功能奠定了基础。

超敏CRP单克隆抗体制备及其ELISA体系的初步建立

目的获得CRP特异性单克隆抗体并建立能够检测超敏CRP(hs-CRP)的双抗体夹心ELISA免疫定量检测方法。方法从NCBI核酸数据库中获得人CRP编码序列并进行密码子偏嗜性改造,利用E.coli表达系统表达CRP重组蛋白。用pET22b-CRP重组质粒表达的CRP重组蛋白(rhCRP-22b)作为免疫原免疫Balb/c小鼠并通过杂交瘤技术制备CRP特异性单克隆抗体,鉴定并筛选能够建立双抗体夹心ELISA系统的抗体配对。以pET28a-CRP重组质粒表达的CRP重组蛋白(rhCRP-28a)作为标准品,对该系统线性范围、灵敏度、精密度和准确度(回收试验)进行分析和评价。结果获得5株CRP单克隆抗体,筛选得到2株单克隆抗体可用于hs-CRP的ELISA免疫检测。通过鉴定2株抗体具有良好的效价和特异性。ELISA检测系统线性范围为0～166 ng/ml,灵敏度为5.2 ng/ml,批内CV≤6.43%,批间CV≤5.93%,平均回收率为98.9%,与Orion公司hs-CRP诊断试剂检测结果有良好的可比性。结论本研究制备了高效特异的CRP单克隆抗体并建立了能够检测hs-CRP的双抗体夹心ELISA方法,该方法灵敏度、精密度和准确性良好,能够达到hs-CRP的检测要求,为进一步研发和建立具有自主知识产权的免疫检测试剂盒及其他检测方法体系奠定了良好的基础。

曼氏迭宫绦虫果糖-1,6-二磷酸酶的生物信息学分析、基因克隆及蛋白表达

目的通过生物信息学分析预测曼氏迭宫绦虫果糖-1,6-二磷酸酶(SmFBPase)的生物学特性,同时对SmFBPase进行基因克隆及蛋白原核表达。方法通过NCBI网站对SmFBPase基因序列进行开放阅读框分析和核苷酸序列同源性分析。通过ExPASy网站预测SmFBPase的理化性质、结构及表位等特性。构建pET-28α-SmFBPase重组质粒,并转化入~E.coli^BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对其诱导表达,用Western blot进行鉴定。结果SmFBPase由337个氨基酸组成,无信号肽、无跨膜区,理论相对分子质量约37×10~3,为稳定胞内蛋白。SmFBPase的氨基酸序列与人FBPase的氨基酸序列一致性为61.77%,且进化树中两者亲缘性较远,该蛋白含有13个B细胞表位。PCR、双酶切鉴定及测序分析,证明重组质粒构建成功。Western blot显示重组质粒转化BL21后成功诱导表达SmFBPase蛋白。结论生物信息学分析SmFBPase是一个具有潜在研究价值的药物靶点,原核表达的SmFBPase具有反应原性,为研究其糖代谢规律奠定了基础。

基于甲基化反应系统检测SETD3甲基化组蛋白的位点

[目的]构建pEGX-4T-1-Setd3,表达并纯化GST-SETD3蛋白;用获得的蛋白进行体外甲基化反应并鉴定其活性,建立体外甲基化反应系统。[方法]PCR扩增小鼠全长Setd3,插入到pEGX-4T-1载体获得pEGX-4T-1-Setd3质粒。将质粒转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-SETD3蛋白并进行纯化。将获得的GST-SETD3蛋白定量后进行体外组蛋白甲基化反应,用Western Blot检测GST-SETD3对组蛋白H3K4及H3K36的甲基化情况。[结果]p GEX-4T-1-Setd3质粒构建正确,纯化的GST-SETD3蛋白纯度较高;甲基化反应结果表明,用不同来源的组蛋白、反应时间、反应缓冲液及检测方法均检测不到GST-SETD3二甲基化H3K4;GSTSETD3可以二甲基化H3K36。[结论]成功表达和纯化GST-SETD3蛋白;该蛋白可以使H3K36发生二甲基化,但不能使H3K4二甲基化。成功构建体外甲基化反应系统。