瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白的亚细胞定位及致病作用浅析

瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)是近些年来出现的一种烟粉虱Bemisia tabaci传播的植物病毒,在瓜类生产中造成了严重损失。为了解该病毒外壳蛋白(coat protein,CP)在病毒侵染寄主过程中的亚细胞定位和致病作用,本研究以CCYV山东黄瓜分离物为研究对象,构建了荧光表达载体CP-YFP和异源表达载体pGR-CP。浸润荧光表达载体48 h后的本氏烟Nicotiana benthamiana叶片在激光共聚焦显微镜下可以观察到荧光信号在细胞质和细胞核内均有分布;浸润异源表达载体的本氏烟植株7 d后上部叶片开始显现花叶症状,13 d后顶部新叶出现严重皱缩和坏死斑点。以上结果表明CCYV CP蛋白参与了病毒对寄主的侵染过程,可能是症状形成的致病相关因子。本研究为进一步解析该病毒的致病机理提供了初步的理论支持。

辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备和应用

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是茄科植物生产上危害最严重的病毒之一,也是口岸检疫的对象。本研究旨在制备特异性强的ChiVMV外壳蛋白的多克隆抗体并用于田间病株的检测。【方法】通过RT-PCR方法扩增ChiVMV贵州烟草分离物外壳蛋白基因的全长(861 bp)和部分片段(396 bp),分别重组至原核表达载体pET28a中,转化Escherichia coli BL21后进行诱导表达,表达产物层析分离和透析纯化后免疫大耳兔制备多克隆抗体,最后使用酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot等方法检测抗体效价和特异性。【结果】成功制备了ChiVMV外壳蛋白的两种多克隆抗体antiCP^(1-287aa)、antiCP^(1-132aa),抗体效价分别为1∶6400、1∶12800;两种抗体antiCP^(1-287aa)、antiCP^(1-132aa)均能通过Western blot方法检测到抗原;田间病株的间接ELISA检测显示,antiCP^(1-132aa)能特异性检测ChiVMV病株,未能检测到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病株,而antiCP^(1-287aa)无法区分这两种病株。【结论】多克隆抗体antiCP^(1-132aa)的特异性较强,可用于ChiVMV田间病株的检测,也为ChiVMV外壳蛋白的功能研究奠定基础。

中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白(CP)特异性抗体的制备与应用

中国小麦花叶病毒(CWMV)是浙江省农业科学院发现并鉴定的一种土传病毒,其RNA2编码的外壳蛋白(CP)在病毒侵染过程中发挥重要功能。为了检测该蛋白表达并分析其生物学功能,该研究采用RT-PCR方法从感染CWMV小麦病叶中扩增获得CP基因,并通过In-Fusion技术构建了CWMV CP重组表达载体,将其导入BL21(DE3)菌株诱导表达;原核表达的重组CP蛋白经镍柱亲和层析纯化后注射免疫家兔,收集抗血清经亲和层析纯化获得CP多克隆抗体。Dot-ELISA、ID-ELISA、Western blot显示,该抗体不仅对CWMV具有高度的特异性,而且其效价高达1∶2.048×10^(7)、灵敏度达6.25×10^(-2)ng。应用该抗体采用Dot-ELISA、Western blot方法检测田间小麦样品显示其可用于CWMV的准确诊断,这为CWMV病毒病检测、CP定量分析及其功能研究奠定了基础。

玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白基因原核表达与抗血清制备

玫瑰叶畸形病毒(rosa rugosa leaf distortion virus,RrLDV)属于番茄丛矮病毒科Tombusviridae天竺葵环斑病毒属Pelarspovirus,能够引起月季叶片畸形、黄化以及提前衰老等症状,是危害月季的病毒之一。为建立玫瑰叶畸形病毒的快速检测方法,采用热硼酸盐法提取发病月季叶片总RNA,通过RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白基因,连接至原核表达载体pDB-His-MBP上,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21以IPTG,诱导蛋白表达,获得浓度为8 mg/mL的重组蛋白,制备了兔多抗血清。Western blot检测血清效价为1∶2048000,当效价为1∶1000时,灵敏度为1∶1024。血清学检测结果与RT-PCR检测结果一致,表明该抗血清可用于RrLDV的检测,有利于检测该病毒的发生和分布。

玉米黄花叶病毒外壳蛋白的特征分析及亚细胞定位

玉米是中国种植面积最大的作物,可作为粮食、饲料和工业原料,玉米病毒病害是玉米最为严重的病害之一,对玉米生产威胁巨大。玉米黄花叶病毒(Maize yellow mosaic virus, MaYMV)于2016年由Chen等^([1])在中国首次发现并报道,随后在亚洲其他国家、南美洲和非洲等地被相继报道^([2-9])。在中国,该病毒已扩散至云南、四川、福建、安徽和河南等地^([10])。

球孢白僵菌真菌病毒BbPmV-4外壳蛋白多克隆抗体制备及应用

真菌病毒Beauveria bassiana polymycovirus 4(BbPmV-4)的感染能够提高寄主球孢白僵菌的致病力,然而其在寄主中的复制、传播和与寄主互作机理尚不清楚。本研究构建了真菌病毒BbPmV-4外壳蛋白(coat protein,CP)的原核表达载体pET-28a(+)∷BbPmV-4-CP,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),进行蛋白原核表达,免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,并利用间接ELISA,Western blot和免疫荧光等血清学方法进行病毒在寄主胞内定位和胞外复制的检测。结果表明,所表达BbPmV-4-CP为一种可溶性蛋白,相对分子质量约为28.56 kD;所制备的BbPmV-4-CP兔源多克隆抗体效价为1∶256000;Western blot检测验证了所制备抗体能够识别对应抗原蛋白及寄主球孢白僵菌中的病毒BbPmV-4;利用所获取的多抗BbPmV-4-CP对含病毒BbPmV-4的球孢白僵菌培养上清液及沉淀中的病毒含量进行间接ELISA检测,结果显示,培养上清液中存在病毒,表明真菌病毒BbPmV-4可在寄主球孢白僵菌体内复制并游离到寄主体外;免疫荧光检测结果显示该病毒定位于真菌细胞核上。本研究制备了高效价和特异性的真菌病毒多克隆抗体,建立了球孢白僵菌真菌病毒的血清学检测技术体系,为研究真菌病毒在寄主体内的复制及其与寄主真菌的互作机理研究提供实验材料,并且可以利用病毒感染及其互作基因调控寄主毒力,创制高毒力球孢白僵菌菌株。

本氏烟组蛋白H4与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染

以番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)外壳蛋白(Coat protein,CP)为研究对象,通过荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay,LCI)研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示,ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中,组蛋白H4定位于细胞核中,两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明,烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术沉默本氏烟烟草中的H4基因,对沉默H4基因的植株接种ToMMV,接种后第4 d,通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量,发现病毒含量显著低于对照组,结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制,组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细胞核内发挥作用,进而使病毒完成系统侵染。

猕猴桃种传潜隐病毒外壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

猕猴桃种传潜隐病毒(actinidia seed borne latent virus, ASbLV),属于乙型线状病毒科Betaflexiviridae李属病毒属Prunevirus,是一种在我国猕猴桃上广泛发生的病毒。本研究通过RT-PCR方法克隆ASbLV的外壳蛋白基因,并连接到原核表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌Rosetta (DE3),经IPTG诱导后可表达分子量约为28 kD的融合蛋白。经过Ni^(2+)-NTA树脂纯化融合蛋白,然后以其为抗原制备多克隆抗体。Western blot结果表明,多克隆抗体的效价为1∶4 000。该多克隆抗体只与ASbLV发生特异性反应,而不与猕猴桃病毒1、猕猴桃病毒A、苹果茎沟病毒、柑橘叶斑驳病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒发生反应,说明该多克隆抗体特异性良好。利用间接ELISA对36份猕猴桃田间样品进行了ASbLV检测,检测结果表明其中20份样品被ASbLV侵染,且间接ELISA检测结果与RT-PCR检测结果一致。本研究建立的间接ELISA方法能够有效地应用于猕猴桃田间样品中的ASbLV检测。

黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较

对我国分离的经生物学和血清学鉴定为黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组Ⅰ和Ⅱ的各一分离物（ＧＢ、ＸＢ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因进行了序列分析和比较。以提纯病毒ＲＮＡ为模板，进行逆转录及ＰＣＲ扩增，并通过常规基因克隆方法得到插入ＣＰ基因片段的重组克隆。对插入ＧＢ和ＸＢ两个分离物ＣＰ基因片段的重组克隆进行全序列测定，结果表明重组克隆序列长分别为７７７ｂｐ和７９２ｂｐ，均只含一个开放读框（ＯＲＦ），长度为６５７ｎｔ，可编码２１８个氨基酸；两个分离物的ＣＰ基因核苷酸序列同源率为７７５％，氨基酸序列同源率为８２６％。与我国已报道的７个ＣＭＶ分离物的ＣＰ基因序列比较，分离物ＧＢ的同源率为９１３％～９７３％，分离物ＸＢ的同源率为７６６％～７８４％。与国际上已报道部分ＣＭＶ株系的ＣＰ基因序列相比较，分离物ＧＢ与亚组Ⅰ株系有更密切的亲缘关系，而分离物ＸＢ则与亚组Ⅱ株系的亲缘关系更密切。

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

以小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)的中国分离物(CH-87)接种发病的叶片中提取的总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得ZYMV CP基因,将其克隆到pUCm-T质粒上进行序列分析。结果表明该CP基因由837个核苷酸组成,编码279个氨基酸。与已发表序列相比较,该CP基因与国际上已报道的4个基因型不同,应属于新的基因型,暂命名为基因型Ⅴ。

大蒜E病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

设计特异性引物PCR扩增了余杭大蒜病样中的大蒜E病毒 (GarV E)的全长CP基因 ,构建原核表达载体并在大肠杆菌中过量表达 ,纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。Westernblot检测结果表明 ,抗血清与GarV E的CP起强的特异性反应。 7个大蒜样品中 ,内蒙古赤峰市、宁夏银川和甘肃天水等 4个样品受到GarV E的侵染。试验也证明了田间GarV E编码的CP分子量为 35kD ,不同于已报道的其他葱X病毒属成员的 2

转WMV-2外壳蛋白基因西瓜植株的病毒抗性

西瓜是夏季的重要水果 ,病毒病是影响其品质和产量的重要原因之一。植物基因工程的发展为抗病育种提供了新途径。利用外壳蛋白 (coatprotein)基因转化高等植物 ,赋予转基因植物以相应抗病性的成功例子已很多。本文报道WMV - 2CP基因在转基因西瓜植株中的遗传、分离、表达以及转基因植株对病毒病的抗性实验结果。通过自交结合PCR检测 ,发现WMV - 2CP基因在自交子一代的分离符合孟德尔 3∶1的分离比。经过连续 4代的选择鉴定 ,已从T7、T11和T32 3个独立转化子的后代中筛选获得 8个转基因纯合株系 ,性状表现整齐一致。Westernblot结果表明 ,R4 T7-1、R4 T11-3以及R4 T32 -73个不同来源的株系均能表达产生外壳蛋白。转基因纯合株系WMV - 2感染后的病毒抗性实验表明 ,与未转基因对照相比 ,转基因株系可以推迟发病时间 ,减轻发病程度。实验筛选获得的转基因株系R4 T32 -7表现出对WMV - 2的高度抗性 。

瞬时表达靶向TMV外壳蛋白基因的siRNA能干扰病毒侵染

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞后,该mRNA发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)作为RNAi途径的重要中介, 已被广泛应用于动、植物抗病毒治疗研究。本文以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因为靶位,设计合成表达小干扰RNA的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达载体pBI121中,直接转化根癌农杆菌。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究了同源于TMV外壳蛋白的siRNA对TMV侵染的干扰作用。结果表明,瞬时表达的siRNA能够特异性干扰TMV侵染。含有重组表达载体pBI121／siRNA的根癌农杆菌渗入普通烟植株,在TMV接种后14 d其上部叶片没有表现典型的花叶症状。对这些叶片进行Northern杂交试验也没有检测到TMV病毒的RNA积累或仅有很少量的积累。在枯斑寄主心叶烟上,siRNA的瞬时表达可使TMV侵染后的枯斑数明显减少,甚至不产生枯斑。此外,同源于TMV外壳蛋白的siRNA瞬时表达对非同源的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)没有抑制作用,表明siRNA的干扰作用具有高度的同源依赖性。

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的构建

以番木瓜环斑病毒黄斑分离物(PRV—YS)RNA为模板,在人工合成的两端引物引导下,反转录合成了外壳蛋白(CP)基因cDNA第一链并通过PCR扩增获得双链cDNA。用重组有cDNA的pUC19转化E.coli DH52,采用双脱氧链终止法进行了cDNA序列分析,结果表明CP基因为861nt,与文献报道的相比,同源率90%,且少连续的6nt。

翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

利用RT PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系 (PVYN)的可翻译和不可翻译外壳蛋白 (CP)基因 ,并分别插入 pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 介导的基因转化方法 ,将可翻译和不可翻译的PVYN CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中 ,得到抗卡那霉素的再生植株。对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明 ,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的 95 %和 98%。攻毒实验表明 ,两种类型的转基因烟草对PVYN 的抗病性具有相似性 ,其表现型为 :免疫、抗病和感病。免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响。Southern印迹杂交结果显示 ,目的基因已经整合到烟草基因组中。Northern印迹杂交证明 ,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达 ,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关。Western印迹杂交表明 ,在表达不可翻译PVYN CP基因的转基因植株内未检测到CP蛋白 ,而在导入可翻译的PVYN CP基因的植株内检测到了CP蛋白 ,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关。本研究结果证明 ,表达可翻译与不可翻译PVYN CP基因的转基因烟草对PVYN 的抗病性均为RNA介导的抗病性。

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因导入西瓜的遗传转化

研究了西瓜品种ZKM的再生体系和农杆菌介导小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus,ZYMV)的外壳蛋白(cp)基因导入西瓜的遗传转化体系。结果表明,质量分数0.6%琼脂是适宜种子萌发的基本培养基,切取5d龄的西瓜无菌苗子叶为外植体,接种在MS+BA2.0mg/L诱导培养基上,诱导不定芽效率最高。选用75mg/L卡那霉素筛选西瓜抗性芽较为合适,外植体经预培养2～3d,菌液浓度以OD600nm值为0.4,共侵染10min有利于提高西瓜转化的效率。经PCR检测,ZYMVcp基因已经导入西瓜植株,转化频率为0.15%。

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因的表达及其表达产物抗血清的制备

将甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因克隆到ｐＢＶ２２０质粒上，构建成在大肠杆菌中经温度诱导表达的载体ｐＢＶＳ４。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｍ印迹结果表明，ｐＢＶＳ４在大肠杆菌ＤＨ５α中通过４２℃诱导后，特异地表达２１ｋＤ的甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白。经光密度扫描估测，其表达量占大肠杆菌全蛋白的１５．２％。分离纯化经温度诱导表达的甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白作为抗原，免疫家兔制备出了特异性强的ＢＮＹＶＶ抗血清。采用微量沉淀法测定其效价为１：１０２４。

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因在甜菜转基因植株中的表达

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因在甜菜转基因植株中的表达姚华建李大伟于嘉林邢怡明蔡祝南刘仪（中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京１０００９４）甜菜坏死黄脉病毒（ＢｅｔＮｅｃｒｏｔｉｃＹｅｌｏｗＶｅｉｎＶｉｒｕｓ，ＢＮＹＶＶ）是一种由甜菜多粘菌（Ｐｏ...

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白(CP)基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒(CTLV)分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714nt,推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5%～99.9%和91.1%～99.6%。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草抗病机制

根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系 (PVYN)核苷酸序列 ,克隆了PVYN外壳蛋白 (CP)基因 ,通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)LBA4 4 0 4介导的方法 ,转化烟草NC89,获得了 38株PCR呈阳性的转基因植株 .攻毒试验发现 ,转基因植株对PVYN的抗性水平存在着差异 ,其中有 4株表现为高度抗病性 .Southernblot表明 ,PVYN CP基因已经整合到烟草染色体中 ,转基因的拷贝数与植株的抗病性成正相关 .Northernblot表明 ,PVYN CP基因在RNA水平上得到了表达 ,而且PVYNCPRNA在细胞中的积累量与转基因植株的抗病性呈明显的负相关 .Westernblot表明 ,高度抗病植株未检测到转基因CP蛋白质 ,而抗病和感病植株都检测到了PVYN CP蛋白 ,且不同抗性的转基因植物中转基因蛋白质的积累有一定的差异 .实验结果表明 ,表达PVYN CP基因的转基因烟草其抗病机制类似于转录后的基因沉默 ,即抗病性可能是RNA介导的 .图 7表 1参