猪细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆、序列分析及蛋白质结构预测

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株序列,利用Oligo 6.0软件设计1对扩增NS1全基因的特异性引物,对从贵州省安顺地区检测到的PPV的NS1基因进行扩增、克隆、测序、序列分析和蛋白质结构预测分析。测序结果表明,扩增的目的基因长度为1986bp,共编码659个氨基酸,其中NS1基因的1287、1288和1298位碱基发生了缺失,导致429、430和433位氨基酸发生缺失。系统发生树结果表明,本试验测序的NS1基因与NADL-2弱毒株处在同一进化分支;氨基酸同源性与NADL-2弱毒株和Kresse毒株最高,均为98.6%。蛋白质结构预测分析结果表明,非结构蛋白NS1的分子质量为75269.76u,理论等电点pI为7.25,不稳定系数为41.57,推测其为不稳定蛋白质;脂肪指数为73.58,总体平均亲水性为-0.565,推测该蛋白质是一种亲水性蛋白质;该蛋白质含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈连续分布;非结构蛋白NS1无跨膜区和信号肽;预测非结构蛋白NS1含有3个N-糖基化位点、3个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、22个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、8个N-肉豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点及1个ATP/GTP结合位点基序A(P-环);该蛋白质抗原表位较多,存在10个主要的抗原表位。

中国水仙凝集素基因NTA的克隆、序列分析及蛋白结构预测

凝集素是一种糖专一性结合蛋白,它可以识别不同的糖类。植物凝集素是植物防御系统重要的组成部分。本研究采用RT-PCR的方法,从中国水仙花蕾中克隆了凝集素基因NTA,运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析以及对其蛋白结构进行预测。结果表明,得到的NTA基因全长698bp,包含一个完整的开放阅读框516bp。该基因编码一个含有172个氨基酸的凝集素前体蛋白,该前体蛋白的等电点和分子量分别为5.84和18615.19Da。序列比对结果表明该基因编码的蛋白与其他单子叶植物如杂种水仙、雪花莲、君子兰、石蒜花和孤挺花的凝集素蛋白的同源性较高,分别为84%、80%、77%、78%以及82%。蛋白结构预测表明,中国水仙凝集素蛋白与洋水仙凝集素蛋白在结构上非常相似。对该基因编码的蛋白进行分析及蛋白结构模拟可知,该蛋白含有三个特殊的功能结构域和alpha-D-甘露糖结合表面(QXDXNXVXY)。

鸡IL-2基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

根据GenBank中已发表的鸡白细胞介素2(IL-2)mRNA基因序列,利用Premier5.0软件设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出鸡IL-2基因。经琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为432bp,分离纯化片段,克隆入pMD-18T载体,转化DH5α感受态细胞,获得阳性重组质粒,经酶切鉴定,测序结果显示,该基因全长432bp,含有一个432bp的开放阅读框,编码143个氨基酸。生物软件分析结果表明该序列与GenBank中发表的鸡的IL-2的核苷酸序列同源性为98.8%,与黄牛、马、鸡、绵羊、牛、犬、人、山羊、鼠、水牛的核苷酸同源性分别为31.2%、28.2%、27.3%、30.6%、26.2%、31.7%、30.1%、30.8%、26.6%、30.6%。与GenBank中发表的鸡IL-2编码的氨基酸序列同源性为95.8%,与上述动物的氨基酸序列同源性分别为7.6%、7.6%、9.7%、7.6%、6.9%、10.4%、11.8%、7.6%、9.0%、7.6%、10.4%。这表明鸡的IL-2基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用IL-2增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。

内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株gag基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

提取内源性绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株(NM)总DNA,参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株gag基因序列设计1对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的gag基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中进行测序得到完整的gag基因序列,并用DNAStar软件进行序列分析,分析结果表明,与内源性南非代表毒株enJS56A1(AF153615)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为98.9%。推导出的氨基酸同源性为98.4%。与外源性美国代表株JSRV21(AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为89.6%,氨基酸同源性为94.8%。利用生物信息学软件对其蛋白结构进行预测,结果表明gag-enJSRV-NM为一结构松散的蛋白分子,这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的全序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定了基础。

刚竹属3种重要散生竹光系统Ⅰ基因(Lhca1)的克隆、序列分析和蛋白结构预测

光系统Ⅰ(PSⅠ)在植物光合系统中具有重要功能,Lhca1是编码PSⅠ复合物中最主要的捕光色素蛋白LHCⅠ的基因。该研究采用RT-PCR法,从毛竹中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因LhcaPe01(GenBank EU035496)的全长,从红壳竹和角竹中克隆了长度分别为616、613 bp的捕光叶绿素a/b结合蛋白基因片段LhcaH01(GenBank EU513200)、LhcaJ01(GenBank EU513201)。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行预测。结果表明,LhcaPe01基因序列从第39 bp开始到第779 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子,该基因全长1051 bp,在5′端有38 bp的非编码区,在3′端含有242 bp的非编码区和Poly(A)30 bp。对这3个基因的保守片段的序列分析表明,刚竹属3种竹种毛竹、红壳竹和角竹保守区内核酸序列同源性非常高,在禾本科内不同属之间毛竹与大麦序列同源性最高,玉米次之。编码的氨基酸序列同源性与核酸序列同源性一致,最高是毛竹与大麦,水稻次之。经推测LhcaPe01编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.4000和22107.34 D。蛋白质结构预测表明,毛竹、大麦、水稻、玉米的LHCⅠ蛋白结构非常相似。

异育银鲫Toll样受体3的cDNA序列分析与蛋白质高级结构预测

利用RT-PCR、RACE及克隆等方法获得了异育银鲫Toll样受体3(cagTLR3)基因全长cDNA序列。该cDNA全长3170bp,5′端非编码区181bp;3′端非编码区283bp;开放阅读框(ORF)2706bp,编码901个氨基酸。经序列同源性分析显示,其编码的氨基酸序列与金鱼、斑马鱼、斑点叉尾、虹鳟和红鳍东方有较高的相似性,其相似性分别为92%、88%、79%、75%和72%,说明TLR3在长期的进化中具有较高保守性。TLR3全长序列起始21个氨基酸残基为信号肽;50至695个氨基酸残基间包含15个富含亮氨酸的重复序列(LRR);704至726个氨基酸残基为跨膜区(TM);754至897个氨基酸残基为与白介素-1受体高度同源的区域(TIR)。将异育银鲫TLR3与人和斑马鱼胞内TIR结构的氨基酸比对后发现,Phe728、Leu738、Tyr756与Arg736在TLR3的信号转导及胞内定位过程中起到关键作用。异育银鲫TLR3胞外配体结合域的三维结构呈U型,与人TLR3的相应结构十分相似,在N端具有1个二硫键,C端有2个。因LRRs上的插入序列和14个糖基化位点,异育银鲫TLR3胞外配体结合域内表面的大量β-折叠结构呈平坦的平面。

广西巴马小型猪β-干扰素基因的克隆、序列分析和蛋白结构预测

从刀豆素A刺激12 h和15 h的巴马小型猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出β-干扰素(IFN-β)基因,将其克隆到PMD18-T载体上,进行序列分析和蛋白结构预测。结果表明,克隆的巴马猪IFN-β基因氨基酸序列与GenBank上登录的梅山猪和长白猪的IFN-β基因氨基酸同源性为98.4%和98.9%,与人、牛、马的IFN-β氨基酸同源性分别为65.1%,65.1%,66.1%。人和猪IFN-β基因在5个螺旋结构序列上同源性很高,而且在维持蛋白结构和生物学活性上的氨基酸位点也非常保守。

荣昌猪SLA-DQB基因β1结构域突变分析及蛋白质序列模式预测

为了深入了解荣昌猪SLA-DQB基因β1结构域的变异及蛋白质序列模式分布情况,对53头荣昌猪SLA-DQB基因的β1结构域进行了克隆测序和序列多重比对,并在线预测蛋白质序列模式。结果发现,222bp区域内存在9个单核苷酸的插入位点、16个单核苷酸的缺失位点和89个SNPs位点。74个氨基酸中仅由SNP位点导致的氨基酸变异位点共37个,其中有24个位点氨基酸的类型发生变化。对50条SLA-DQB基因β1结构域蛋白质序列分析发现7种类型共174个蛋白质序列模式位点。单条序列中蛋白质序列模式位点最多的12个,最少的2个。蛋白质序列模式突变位点主要发生在第9、26、45、53、61个氨基酸上,涉及到5种类型蛋白质序列模式位点的改变。结果提示,荣昌猪SLA-DQB基因β1结构域存在丰富的遗传变异和多样化的蛋白质序列模式。

牙鲆碱性磷酸酶cDNA序列分析与蛋白质高级结构预测

为研究碱性磷酸酶(EC3.1.3.1;alkaline phosphatase,ALP)在牙鲆(Paralichthys Olivaceus)发育和变态中的作用,采用RACE的方法克隆了牙鲆ALP基因cDNA全长,通过生物信息学分析了核苷酸序列并进行蛋白结构预测.结果表明,牙鲆ALPcDNA全长为1811bp,能编码476个氨基酸的蛋白质,分子量为52293.1,等电点为7.67.编码区核苷酸GC含量在ALP同源基因中差异比较大,脊椎动物明显高于非脊椎动物和细菌.分子系统分析显示,牙鲆ALP和青黑斑河豚(Tetraodonnigroviridis)、斑马鱼(Danio rerio)的组织非特异性ALP有较高的同源性,分子进化树和物种进化树是一致的.在蛋白序列中的一些重要的功能位点,包括金属离子结合位点、N糖基化位点和丝氨酸磷酸化位点等表现了较高的保守性.牙鲆ALP和人胎盘ALP(PALP)在蛋白序列上有43%的相似性,其3D结构非常接近.通过氨基酸空间位置比较发现,牙鲆ALP中141和203位半胱氨酸对应于人PALP的121和183位半胱氨酸,推测能形成一个二硫键.在两者酶活性中心,3个金属离子结合的氨基酸残基非常保守,Zn离子周围的9个氨基酸中有2个不同;Mg离子周围的7个氨基酸也只有2个不同,包括一对类似的丝氨酸155和苏氨酸175.

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

GM-CSF在机体免疫系统中发挥重要的免疫调节作用。用PHA与LPS体外联合刺激猪外周血单个核细胞,采用RT-PCR技术成功克隆了猪GM-CSF基因。序列分析表明,该序列与NCBI/GenBank上登载的序列有两个碱基不同;将猪与人、牛、羊、狗、猫、鼠等动物的GM-CSF基因序列相比较,其一致性分别为82.1%8、5%、88.1%、82.8%、83.7%、70.5%,在氨基酸水平上一致性为70.3%7、0.9%7、8.1%、70.3%7、1.9%、54.4%。然后利用生物信息学和分子生物学软件,对猪GM-CSF的结构进行预测,结果表明,猪GM-CSF为一结构松散的球状蛋白分子。猪GM-CSF基因的成功克隆及其编码蛋白结构的预测为开发高效、低毒且性质稳定的猪GM-CSF产品奠定了基础。

中国人HLA-G1的cDNA克隆、序列分析、表达和蛋白质空间结构预测

从中国人外周血单个核细胞、胎盘组织和肝癌组织等样品中克隆了包含完整HLA G1读框的cDNA ;与国外同行获得的该基因及其蛋白质序列比较分析表明 ,该基因虽然有着细微的种族特异性 ,但高度保守 ;并获得了它的截断型重组蛋白 ,根据蛋白一级结构和同源比较方法 ,模建了它及其与特异性受体KIR2DL4形成复合体的空间结构模拟 。

犬γ-干扰素基因的克隆、序列分析及蛋白质结构预测

根据Gen Bank上犬γ-干扰素基因(IFN-γ)序列(序列号WO318193),利用Primer 5.0软件设计特异性引物,应用RT-PCR技术从100μg/ml Con A刺激24 h后的犬外周血淋巴细胞总RNA中扩增出γ-干扰素基因,测序后应用DNAStar软件对克隆的犬γ-干扰素基因进行序列分析,并与Gen Bank上发表的犬、牛、大熊猫、鸡、牦牛、人、猪、野猪、斑马鱼、土拨鼠等的IFN-γ基因序列进行同源性比较。结果显示,克隆的犬IFN-γ基因大小501 bp,编码166个氨基酸,与犬、牛、大熊猫、鸡、牦牛、人、猪、野猪、斑马鱼、土拨鼠IFN-γ基因的核苷酸序列同源性分别为98.4%、81.6%、26.1%、26.1%、22.7%、22.7%、80.8%、81.0%、28.5%和25.0%;氨基酸序列同源性分别为95.8%、72.5%、5.4%、5.4%、6.6%、6.6%、68.9%、69.5%、5.4%和5.4%。运用DNAstar软件对犬γ-干扰素进行蛋白结构预测的结果显示,犬γ-干扰素蛋白含有10个α-螺旋、9个β-折叠、11个β-转角和5个无规则卷曲。

鸡集落刺激因子(CSF)基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

根据GenBank中报道的红原锦鸡集落刺激因子(Colony-stimulatingfactor,CSF)cDNA序列,利用Primer Premier5.0软件设计一对特异性引物,对本地肉鸡注射100μg/mL ConA试剂,饲养24 h后,取脾脏提取淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆集落刺激因子(CSF)的cDNA片段。对克隆片段进行测序,并利用DNAstar软件进行不同物种间同源性比较。序列分析表明,CSF的cDNA开放阅读框为435 bp,编码144个氨基酸,与红原锦鸡的序列比较,其核苷酸的同源性为98.4%,氨基酸的同源性为95.2%,同人、犬、印度野牛、野猪、绵羊和老鼠的CSF序列作比较,其核苷酸的同源性分别为28.7%,29.2%,33.6%,30.8%,29.4%和34.7%,氨基酸的同源性分别为8.3%,9.0%,15.3%,12.4%,11.0%和12.0%。然后利用DNAstar和DNAman软件,对鸡CSF的结构进行预测,结果表明,鸡CSF基因为一结构松散的蛋白分子。鸡的CSF基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用CSF增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。

A型产气荚膜梭菌青海分离株tetA(P)耐药基因序列分析及蛋白结构预测

应用PCR技术对A型产气荚膜梭菌青海分离株的tetA(P)耐药基因进行扩增、测序,利用生物软件对tetA(P)基因进行序列分析与蛋白结构预测。结果表明,A型产气荚膜梭菌青海分离株的tetA(P)基因长度为1 263bp,编码420个氨基酸。与参考菌株EHE-NE18、Wakayama、CW92的核苷酸序列同源性依次为100%、99.8%和98.7%,氨基酸序列同源性依次为100%、100%和98.3%。分离株TetA(P)蛋白疏水性较强,具有10个跨膜区,含有4个N-糖基化位点,1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,12个N-豆寇酰化位点,三级结构主要是由α-螺旋和无规则卷曲形成。研究结果可为A型产气荚膜梭菌tetA(P)基因功能研究提供依据。

单核细胞增生李斯特菌新疆野毒株XS5 SigmaB操纵子的克隆、序列分析及其编码蛋白结构预测

为了解单核细胞增生李斯特茵（Listeda monocytogenes LM．）新疆野毒株XS5SigmaB操纵子的分子生物学特征。对LM-XS5的SigmaB操纵子部分基因序列进行了克隆与序列分析，预测该操纵子各基因编码蛋白质的二三级结构及功能活性位点，分析其同源性。结果表明：成功扩增出3000bp的SigmaB操纵子片段，序列分析显示该片段中包含Rsb认RsbW,RsbX和SigmaB4个基因，它们编码的蛋白质含有不同的功能活性位点，其中RsbV的5-102位AA为“STAS-抗-抗-SigamB因子”，咫6Ⅳ的43-157位AA间为HATPasec功能域，RsbX的32-198位AA间为PP2Cc超家族区域，SigmaB的8-264位AA为RNA聚合酶全酶中的SigmaB因子的区域。LM-XS5与其他3种革兰氏阳性茵的SigmaB基因的同源率在50％左右，与LM参考株的同源率在92．18％-100％之间。

杨树木质素合成酶CCR基因的序列分析及蛋白结构预测

利用RT-PCR从欧美杨107次生木质部中克隆出一961bp的CCR基因片段。通过生物信息学软件对该序列的核苷酸序列、拟翻译的氨基酸序列的疏水性、残基带电量及表面暴露区、蛋白质二级结构、亚细胞定位及三维结构等进行了初步分析预测。结果表明该CCR基因含一个编码301个氨基酸的完整开放阅读框,其成熟蛋白为亲水性的、主要存在于细胞膜,具有大多数植物CCR蛋白普遍存在的KNWYCYGK的保守性基序,其二级结构中共包含12个α螺旋,20个β折叠,11个卷曲,并构建了其三维结构图。

棉铃虫多核型多角体病毒38k基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构的预测

采用半补齐方法建立棉铃虫多核衣壳型多角体病毒基因组文库,通过对插入片段进行克隆鉴定和序列分析,获得了38k基因。该基因上游具有晚期调控保守序列TTAAG,是一个晚期表达基因,基因阅读框为903bp,共编码300个氨基酸,氨基酸序列同源性分析结果表明其与α类杆状病毒的同源性较高,有较近的亲缘关系。氨基酸高级结构的分析表明其与与磷酸酶结构相似性达到95%,与病毒核衣壳的组装有关。

藏羊IFN-γ基因的扩增、序列分析及蛋白结构预测

为了研究藏羊IFN-γ基因的功能,提取藏羊脾脏总RNA,通过RT-PCR扩增藏羊IFN-γ基因并测序,应用DNA Star软件进行序列分析及编码蛋白结构预测。结果表明,藏羊IFN-γ基因长度为429bp,其中腺嘌呤和胸腺嘧啶含量较高,该基因编码143个氨基酸,其中疏水性氨基酸和亲水性氨基酸的含量较高。藏羊IFN-γ基因与参考绵羊、山羊、藏羚羊和牛IFN-γ基因的核苷酸序列同源性依次为100%、99.3%、99.1%和97.2%,氨基酸序列同源性依次为100%、99.3%、99.3%和95.8%。IFN-γ蛋白主要由α螺旋组成,亲水性较高,含有5种蛋白质功能位点,分别为1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酰胺化位点、2个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点和3个蛋白激酶C磷酸化位点。

非洲猪瘟病毒B646L基因序列分析及p72蛋白质结构与细胞抗原表位预测

为探究非洲猪瘟病毒B646L基因序列的碱基组成特点,及预测该基因所编码的p72蛋白质结构与细胞抗原表位,利用PCR技术对非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框的序列进行扩增、测序及碱基组成分析;运用软件EXPASY、PRABI与SWISS-MODEL对p72蛋白质进行理化性质分析及二、三级结构预测;运用在线软件ABCpred Prediction、Scratch、IEDB和NetCTL对p72蛋白在B、T细胞的抗原表位进行预测。结果表明,非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框序列全长为1941 bp,其中,碱基A含量为26.9%,T含量为28.9%,G含量为24.2%及C含量为20.0%,A+T的含量为55.8%,G+C的含量为44.2%,AT含量显著高于GC含量;该序列共编码646个氨基酸,p72蛋白大小为76 ku;在整个p72蛋白分子的二、三级结构中,α-螺旋占19.35%,β-转角占5.42%,无规卷曲占50.15%,扩展链为25.08%,以无规卷曲为主要结构;该蛋白存在细胞质的概率最大,其次是细胞核,存在于线粒体、高尔基体和内质网的概率较低;p72蛋白B淋巴细胞优势抗原表位分别为12~18 aa、27~37 aa、45~55 aa、77~88 aa、110~120 aa;T淋巴细胞优势抗原表位分别为203~212 aa、298~307 aa、520~531 aa。说明非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框序列呈明显AT偏好性;p72蛋白为一亲水性蛋白,其高级结构主要以无规卷曲为主,且具有B、T淋巴细胞优势抗原表位,是检测试剂和疫苗研发的理想靶标。

鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测

用DNAClub分析软件推导出鲫血清转铁蛋白序列 ,并对该序列进行分析。推导的蛋白质长度为80 7个氨基酸 ,MW约为 90kD。其中半胱氨酸 4 3个 ,可以组成 2 1对二硫键。疏水性和二级结构几率分析表明 :有 2个非常相似的结构域分别存在于 1～ 390和 390～ 80 7区域。旋管结构和螺旋结构的分布区域 ,均分别集中在上述 2个区段中 ,同样位于 2个结构域中 ,结构也非常类似。证实了Tf由 2个同源性较高的结构域 (N结构域和C结构域 )组成。Tf的三级结构呈“V”字形 ,每个结构域又各自分为 3个小的结构小区 (即N1、N2 、N3和C1、C2 、C3 )。 2个糖基位于N1和C1区 ,呈“Y”字型结构 ;铁链位于N2 和C2 区 ;受体结合位点R1和R2 位于N3 和C3 区。