基因工程半成品中大肠杆菌蛋白残余量测定方法研究—双抗体夹心ELISA法

用大肠杆菌ＤＨ５α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清，建立了双抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法。经初步测定，该方法的灵敏度为１．５ｎｇ／ｍｌ，与间接ＥＬＩＳＡ法的灵敏度相似，比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮兰染色方法的灵敏度高将近７００倍，比银染色方法的灵敏度高将近３０倍。在２０～１００００ｎｇ／ｍｌ范围内呈直线关系，直线相关系数为０．９９６。经八次重复测定，显示很好的重复性。该方法可用于测定基因工程产品中ＤＨ５α菌体蛋白的残余量。

水性胶层析改良抗球蛋白试验方法的建立

目的建立水性胶层析改良抗人球蛋白试验(HCI-Coombs T)方法。方法将含红细胞和血清的反应液置于水性胶介质试管中,低速离心使红细胞穿过水性胶到达试管底部,而血清中非特异性球蛋白等滞留在水性胶之上,弃去反应液和水性胶介质后加入抗人球蛋白试剂,离心后观察血凝结果。结果结合了血清中特异性抗体的红细胞通过水性胶至试管底部,与后加入的抗人球蛋白发生凝集反应,即为阳性结果;反之为阴性反应。以HCICoombs T做直接和间接抗人球蛋白试验,其检测抗-D的敏感性与试管法Coombs T一致,低于微柱凝胶法。抗-A、抗-B试剂不能通过水性胶介质,沉淀中非特异性球蛋白残余量4μg/mL,沉淀中残余的碱性磷酸酶经3 200倍稀释抗人球蛋白OD值为0.175,而常规洗涤3次后残余蛋白OD值1.235。结论采用HCI-Coombs T,1次离心便分离反应液中的红细胞抗原抗体复合物和非特异性球蛋白经水性胶介质,离心沉淀中残余非特异性球蛋白不足以中和随后加入的抗人球蛋白试剂,避免了试验中繁琐的洗涤程序。可望应用于在临床常规血型相容性试验中。

浊度法和紫外分光光度法在器械清洗质量评估中的应用

目的应用浊度法和紫外分光光度法对手术器械清洗质量进行评估,避免器械清洗不合格导致灭菌失败的手术器械应用到临床引发交叉感染。方法收集与手术器械清洗直接相关的终末漂洗后的水,先用浊度法检测溶液的澄清度,确保将下一道考马斯亮蓝法的分光光度法测定其蛋白质的干扰因素降至最低,再运用考马斯亮蓝法测定其蛋白质残余量,以此判定是否清洗合格。结果浊度法在4~100浊度范围内线性关系良好,检测限为0浊度,回收率为92.5%~94.2%,测定样品67个,66个为“澄清”溶液,一个为“几乎澄清”溶液。考马斯亮蓝法的线性范围为0.20~16.0μg·mL^(-1),检测限为0.197μg·mL^(-1),回收率为93.6%~95.4%,测定样品67个,合格率为100.0%。结论紫外分光光度计结合考马斯亮蓝法测定终末漂洗水的蛋白残余量具有简便快速、高灵敏度的优点,在消毒供应中心中用于评价医疗器械清洗效果具有重要意义。

微载体无血清培养水痘-带状疱疹病毒的效果

目的探讨利用生物反应器微载体无血清培养水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)的效果。方法利用生物反应器,将人二倍体细胞2BS培养至在微载体上形成单层后,分别采用BD008无血清培养基及含有2%新生牛血清的MEM维持液按MOI为0.004~0.008感染VZV毒种;当细胞呈现70%细胞病变效应(cytopatho-genic effect,CPE)时,无血清培养的细胞沉淀经PBS洗涤1次,含血清培养基培养的细胞洗涤1~3次后收获,分别制备3批VZV原液;噬斑法检测病毒滴度,ELSIA法检测牛血清白蛋白残留量,并对制备的水痘减毒活疫苗(live attenuated varicella vaccine,VarV)进行热稳定性检测。结果洗涤1~3次获得的3批含血清培养VZV原液滴度从5.00 lgPFU/mL降至4. 12 lgPFU/mL;牛血清白蛋白残留量分别为203. 2、120. 3和81.2 ng/mL,前2批超出合格范围(≤100 ng/mL)。洗涤1次获得的3批无血清培养VZV原液滴度分别为4.92、5.00和5.30 lgPFU/mL;牛血清白蛋白残留量分别为75.2、82.3和71.9 ng/mL,均值低于洗涤1及2次含血清培养VZV原液(P <0.05)。3批无血清培养的VarV热稳定性均符合要求。结论获得的无血清培养的VZV原液滴度及牛血清白蛋白残留量均符合《中国药典》三部(2015版)标准,本研究为提高VarV质量及生物反应器微载体工艺改进提供了参考。