不同方法测定基因工程药物中中国仓鼠卵巢细胞蛋白残留量的比较与分析

目的对不同中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞蛋白检测试剂盒进行比较分析以确定最佳检测方法。方法用4种不同的CHO细胞蛋白检测试剂对 32批用CHO细胞表达的基因工程产品原液进行检测 ;用标准品替换方法分析 3批红细胞生成素供试品 ;并对 2种CHO细胞蛋白标准品和 4种供试品进行SDS PAGE分析。结果不同的检测方法之间的结果存在较大的偏差 ;同一检测试剂盒替换标准品后测得结果有较大差异 ;标准品的组成成分和比例存在较大差异。

超滤离心法降低重组人脱细胞真皮基质牛血清白蛋白残留量检测中基质效应的实验研究

目的探讨采用超滤离心法减少重组人脱细胞真皮基质(recombination humana cellular dermal matrix,rhADM)样品浸提液对ELISA方法检测牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)残留量的基质效应。方法清洗rhADM后,制备rhADM生理盐水浸提液。取超滤离心管若干,分别加入1mg/mL BSA溶液(预饱和方式1,记作PR1)、10μg/mLBSA溶液(预饱和方式2,记作PR2)和rhADM浸提液2mL(记作rhADM1和rhADM2),1500×g离心20min,重复操作3次后取出离心管内管,放入未使用的15mL离心管中,在PR1和PR2管中加入10μg/mLBSA溶液4mL,rhADM管中加入rhADM浸提液4mL,同上法离心后,收集滤液。用ELISA法测定BSA含量。计算不同预饱和方式下10μg/mLBSA溶液的BSA回收率(以未经处理的10μg/mLBSA溶液作为基础样品,分别记作R10和R20);计算滤液稀释倍数的对数与测定吸光度(A)值的相关系数,并与未经超滤离心处理的浸提液检测结果进行比较。结果采用预饱和方式1处理后,PR1BSA浓度为(23.80±1.58)μg/mL,R10为(9.04±0.24)μg/mL,BSA回收率为263.4%±16.9%。采用预饱和方式2处理后,PR2BSA浓度为(8.64±0.24)μg/mL,R20为(8.12±1.01)μg/mL,BSA的回收率为106.5%±3.0%。预饱和方式2的回收率符合检测要求。不同预饱和方式下BSA回收率差异有统计学意义(P<0.01)。经超滤离心处理后,滤液稀释倍数的对数与A值之间的相关性明显提高,相关系数由—0.727提高至—0.960。超滤处理后的相关系数符合检测要求。结论超滤离心处理可以有效减少rhADM样品浸提液的基质效应对BSA残留量检测的影响;样品浸提液自身对超滤离心管的预饱和处理,可得到较为理想的BSA回收率。

人用纯化Vero细胞狂犬病疫苗中硫酸鱼精蛋白残留量的测定

用硫酸鱼精蛋白可去除 vero细胞狂犬病疫苗中残存的细胞基质 DNA,使其残余量小于 10 0 pg/剂量 ,但经一系列处理后的疫苗中硫酸鱼精蛋白应无残留 ,方认为安全可靠。我们采用毛细管电泳法 ,检测该种疫苗中硫酸鱼精蛋白残留量 ,在待检样品中硫酸鱼精蛋白未检出 ,该方法最小检出量为 3ppm。

ELISA试剂盒检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量的验证

目的验证ELISA试剂盒检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)中Vero细胞宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量的适用性。方法用同一批ELISA试剂盒检测sIPV中Vero细胞HCP残留量,验证其专属性、重复性、中间精密度、准确度、线性、范围、定量限和耐用性等指标。结果将样品用2种不同稀释液(样品稀释液和疫苗稀释液)稀释后,检测Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL,表明该方法专属性强;同一检验人员检测同一样品6次,Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL;不同检验人员检测同一样品6次,Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL,表明具有良好的重复性和中间精密度;准确度试验中回收率均在99%~106%,CV为2%;在12.5~400.0 ng/mL的线性范围内,标准曲线线性良好(R^(2)>0.98);定量限为50.0 ng/mL;显色时间在25~35 min内对实验无影响,显色温度在36~37℃内对实验无影响,耐用性良好。结论ELISA试剂盒检测sIPV中Vero细胞HCP残留量具有较好的专属性、重复性、中间精密度、准确度、线性和耐用性,可用于sIPV中Vero细胞HCP残留量的检测。

CHO宿主细胞蛋白残留量检测方法适用性验证

目的:对CHO宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量检测方法应用于候选治疗性单克隆抗体(以下简称单抗)产品生产过程中质控和放行检测的适用性进行验证。方法:采用荧光标记的二维差异凝胶电泳(2-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)测定羊抗HCP多克隆抗体对空发酵宿主细胞上清中HCP蛋白的覆盖率;采用统计学方法根据40次检测结果确定检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ);依照人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)Q2要求验证方法特异性、精密性/中间精密性、准确性、线性和耐受性;依照《美国药典》〈1132〉要求验证方法用于过程中质控的适用性、关键HCP清除步骤和各步骤样品测定稀释度范围。结果:2D-DIGE测定羊抗HCP多抗对CHO HCP的覆盖率为56%,应用该抗体建立的CHO HCP检测方法的LOD和LOQ分别为2.47和7.41 ng·mL^(-1)。经验证,方法特异性、精密性/中间精密性、准确性、线性和耐受性均符合要求。系列稀释单抗纯化过程中间产物,采用选定方法进行检测,确定各生产步骤产物HCP测定的稀释范围,计算各纯化步骤的HCP清除率,确定蛋白A亲和层析为HCP的主要清除步骤。根据上述结果,确定所选定的CHO HCP残留量测定方法可做为蛋白A纯化的过程中控制项目和原液的放行项目。结论:所选定CHO HCP检测方法可应用于候选治疗性单抗的过程中控制和放行。

ELISA法测定生物制品中大肠杆菌菌体蛋白质残留量的研究

目的对ELISA法测定生物制品中的大肠杆菌菌体蛋白质残留量进行方法学验证,确定该方法用于大肠杆菌菌体蛋白质残留量质量控制的可行性。方法依据《中国药典》2010年版三部附录ⅨC《大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法》。结果与结论该方法的线性、检测限、专属性和耐用性均符合方法学验证要求,具有简洁、快速、灵敏等优点,可基本满足生物制品行业对大肠杆菌制品中菌体蛋白质残留量质量控制的要求。

蛋白残留定量检测方法在手术器械清洗效果监测中的应用

目的:探讨蛋白定量检测方法在手术器械清洗质量监测中的应用价值。方法:同时采用光源放大镜检测法与蛋白残留量检测法检测手术器械清洗质量。结果:光源放大镜检测法与蛋白残留量检测方法的检测样本阳性率分别为4.01%和23.14%,两组结果比较有统计学差异(P<0.001)。基础器械、妇科、骨科及眼科器械两种方法间的比较均有明显差异(P<0.001,P<0.05,P<0.001,P<0.001)。

冻干甲型肝炎减毒活疫苗成品检定方法的优化

目的对冻干甲肝减毒活疫苗成品检定中关键性项目的检定方法进行优化。方法(1)感染性滴度检测:建立微量免疫荧光法,并与常规组织培养ELISA法比较;(2)牛血清白蛋白残留量检测:比较反向间接血凝法、酶联免疫法的重复性、精确性;(3)水分含量测定:建立助溶剂加入法,并比较助溶剂加入前后冻干疫苗水分含量检测结果。结果(1)微量免疫荧光法灵敏度与常规组织培养ELISA法相仿(P>0.05),重复性佳,可提前1周左右出结果;可用Leica Qwin荧光定量分析系统标定化判断结果。(2)反向间接血凝法测定结果不稳定,2批疫苗5次测定结果的变异系数(CV)为39.12%,34.23%;酶联免疫法的重复性,精确性均较佳(CV)为2.12%,2.82%,回收率为101.73%。(3)助溶剂加入前后2批疫苗5次测定结果的CV分别由8.32%,9.03%降为1.85%,1.82%。结论微量免疫荧光法有望代替常规组织培养ELISA法用于疫苗滴度检测;牛血清白蛋白残留量测定中酶联免疫法优于反向间接血凝法;加入助溶剂有利于提高疫苗水分含量检测的重复性。

3M清洗测试棒的监测效果阳性原因分析

目的:研究用3M清洗测试棒判定医疗器械的清洗效果。方法:在棉签上使用增湿剂并涂抹器械表面采样后,将棉签放入3M清洗测试棒,用A、B、C 3种方法测定医疗器械清洗效果。结果:A组清洗效果呈灰色,监测不合格,而B组和C组清洗后监测效果是绿色,完全达标。结论:不正确的使用含氯消毒剂以及清洗用具不清洁都有可能影响清洗和监测效果,所以正确做好每一步清洗步骤,严格按照标准执行至关重要。