一种单抗制品理论消光系数与实验确证结果的比较

目的本实验通过3种实验方法对1种单抗的消光系数进行实验确证并与理论消光系数进行比较研究。方法根据氨基酸一级序列，计算出单抗在280nm处的理论摩尔消光系数，通过质谱确定单抗相对分子质量，计算出理论消光系数；分别用3种方法测定单抗的蛋白质浓度，根据朗伯－比尔定律C=A／EL计算实验消光系数。方法一为利用尿素变性蛋白测定其非折叠状态（变性状态）的实验消光系数，计算得出折叠状态（天然状态）的消光系数；方法二通过酸水解蛋白，结合AccQ Fluor试剂盒利用HPLC对蛋白进行准确定量，计算该抗体的实验消光系数；方法三通过酸水解蛋白，利用氨基酸序列分析仪对蛋白进行准确定量，计算蛋白的实验消光系数。结果理论消光系数E280为1．453mL·mg^-1·cm^-1；3种实验方法确定的单抗消光系数分别为（1．442±0．009）、（1．529±0．032）、（1．458±0．019）mL·mg^-1·cm^-1，均值为（1．477±0．044）mL·mg^-1·cm^-1，RSD=2．979％（n=9）。研究结果显示，该单抗的理论消光系数与实验消光系数的差异较小（0．069％～7．708％）。结论本实验运用3种方法确证单抗的实验消光系数，所建立的消光系数测定和验证方法可用于抗体药物蛋白含量的测定。

紫外-可见光检测器的高效液相色谱无标准品直接测量蛋白含量的可能性

目的:探讨使用紫外-可见光检测器的高效液相色谱峰面积无标准品直接测量蛋白含量的可能性。方法:通过理论推导得出色谱图峰面积与蛋白含量之间的关系式,在以下三方面检验公式及其成立前提。①用紫外-可见光分光光度计测定白蛋白溶液250～350nm最大吸收波长和该波长下的吸收度(A),同一溶液用不接色谱柱的高效液相色谱分析,通过转换公式:吸收度(A)=流速(F)×峰面积(S)/上样体积(V),计算在某波长下吸收度值(AUV-HPLC)),进而计算与UV测量值(AUV)之比百分数,得到回收率;②通过pH、氯化钠浓度和乙腈浓度变化来检验白蛋白最大吸收波长和该波长下吸收度的稳定性;③估计SEC-HPLC系统在该测量中的误差。结果:推导所得公式为:蛋白含量(C)=[流速(F)×峰面积(S)]/[蛋白消光系数(ε)×样品池长(ρ)×进样体积(V)]。公式成立前提:①系统误差可忽略不计;②蛋白消光系数可视为不变。当高效液相色谱流速在0.8～1.0mL.min-1之间、上样体积在20～100μL范围内白蛋白溶液回收率约为100%。当溶液pH在4.0～8.6之间、氯化钠浓度在2mol·L-1以下时,白蛋白消光系数和最大吸收波长稳定,但乙腈浓度在50%以下时,白蛋白消光系数最大有约5%的增加。SEC-HPLC分析白蛋白的重复性RSD均<1%。回归直线的剩余标准差与各试验点(36.5,29.2,21.9,14.6,7.3μg)峰面积之比的百分数分别为0.6%,0.7%,1.0%,1.4%,2.7%。结论:在特定条件下,紫外-可见光检测器的高效液相色谱无标准品直接测量蛋白含量可以实现。