生长抑素联合人转录因子叉头框蛋白D1通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路调控胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的探讨生长抑素联合人转录因子叉头框蛋白D1(FOXD1)通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路调控胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究。方法研究于2018年12月至2019年12月进行,通过体外培养PANC-1细胞,经过不同浓度(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L)的生长抑素(SST)处理细胞,记为生长抑素各剂量组,其中0 mg/L和400 mg/L的生长抑素作为对照组(Control)和生长抑素组(SST);将过表达载体(pcDNA)和过表达FOXD1(FOXD1)转染至PANC-1细胞,经过400 mg/L的生长抑素及20 mol/L的PI3K抑制剂LY294002处理细胞,记为SST+pcDNA组、SST+FOXD1组和SST+FOXD1+LY294002组。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭;蛋白质印迹法(Western blotting)检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、FOXD1和PI3K/AKT相关蛋白的表达;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测FOXD1 mRNA的表达。结果与Control组相比,SST组可以抑制FOXD1 mRNA(0.47±0.03)及蛋白表达(0.42±0.04)、增殖(0.52±0.05)、迁移(66.8±7.2)和侵袭(63.7±6.5)能力,下调p-PI3K(0.43±0.04)、p-AKT(0.39±0.03)蛋白表达;与SST+pcDNA组相比,SST+FOXD1组可以促进以抑制FOXD1 mRNA(0.67±0.05)及蛋白表达(0.64±0.06)、增殖(0.71±0.07)、迁移(86.9±8.5)和侵袭(81.5±7.3)能力,上调p-PI3K(0.62±0.05)、p-AKT(0.65±0.06)蛋白表达。与SST+FOXD1组相比,SST+FOXD1+LY294002组可以抑制FOXD1 mRNA(0.37±0.04)及蛋白表达(0.35±0.03)、增殖(0.53±0.05)、迁移(67.2±6.5)和侵袭(62.5±5.2)。结论生长抑素通过调控FOXD1的表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT通路有关。

基于AKT/FOXO1信号通路探讨豨莶草提取物对冠心病大鼠心肌损伤的保护作用

目的:基于蛋白激酶B(AKT)/叉头框蛋白O1(FOXO1)通路探讨豨莶草提取物对冠心病(CHD)大鼠心肌损伤的影响。方法:从78只大鼠中随机选取66只大鼠复制CHD大鼠模型,其余12只作为对照组。将造模成功的60只大鼠按随机数字表法分为模型组、豨莶草提取物低剂量组、豨莶草提取物高剂量组、阳性药物对照组、豨莶草提取物高剂量+MK2206组,每组12只。各给药组大鼠分别给予相应药物;模型组、对照组大鼠灌胃给予等体积的蒸馏水,同时尾静脉注射100μg/kg生理盐水,1次/d,连续给药4周。观察心脏功能相关指标心率(HR)、平均动脉压(MAP)、左室收缩压(LVSP)的变化;HE染色、Masson染色分别检测心肌组织病理损伤及纤维化程度;ELISA法检测心肌组织中心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌红蛋白(Mb)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡;Western blotting法检测半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、p-AKT、AKT、p-FOXO1、FOXO1蛋白表达情况。结果:与对照组比较,模型组大鼠HR、MAP、LVSP及心肌组织中p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1均明显降低(P<0.05),心肌组织病理损伤及纤维化程度严重,cTnI、Mb含量,IL-6、TNF-α水平,心肌细胞凋亡率,以及心肌组织中Caspase-3、Bax蛋白相对表达量均明显升高(P<0.05);与模型组比较,豨莶草提取物低剂量组、豨莶草提取物高剂量组、阳性药物对照组、豨莶草提取物高剂量+MK2206组大鼠上述指标变化均呈相反趋势,且差异有统计学意义(P<0.05);MK2206减弱了高剂量豨莶草提取物对CHD大鼠心肌损伤的保护作用。结论:豨莶草提取物可能通过激活AKT/FOXO1通路对CHD大鼠心肌损伤发挥保护作用。

PPAR-α通过PI3K/Akt/FoxO1信号通路对心肌细胞肥大的负性调控作用

目的 :研究过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators activated receptor alpha,PPAR-α)对心肌细胞肥大的负性调控作用以及与PI3K/Akt/叉头框蛋白O1(Forkhead box O1,FoxO1)信号通路和氧化应激的关系。方法:应用异丙肾上腺素(isoproternol,ISO)诱导心肌细胞肥大;采用Leica图像分析软件测量心肌细胞表面积;应用实时定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)、PPAR-α及FoxO1 mRNA表达;采用试剂盒检测心肌细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。结果:(1)ISO诱导心肌细胞肥大,PPAR-αm RNA表达显著下降。(2)应用非诺贝特(Fenofibrate,Feno)上调PPAR-α表达明显抑制ISO诱导的心肌细胞表面积、ANP和β-MHC mRNA表达的增加。(3)ISO诱导心肌细胞肥大,FoxO1表达明显减少;应用Feno预处理可增加FoxO1 mRNA的表达;应用PI3K抑制剂LY预处理亦能明显增加FoxO1 mRNA表达。(4)ISO诱导心肌细胞肥大,心肌细胞SOD活性明显降低,MDA含量明显增加,应用Feno预处理能显著提高SOD活性,降低MDA含量。结论:PPAR-α抑制心肌细胞肥大的作用可能与其抑制PI3K/Akt通路的激活,提高FoxO1的表达,降低氧化应激反应有关。

阿托伐他汀抑制PI3K/AKT/FoxO1通路及高糖诱导的足细胞增殖、凋亡及氧化应激损伤

目的 基于磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/转录因子叉头框转录因子O亚族1(PI3K/AKT/FoxO1)通路研究阿托伐他汀对高糖诱导的足细胞增殖、凋亡、迁移、炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-6]及氧化因子超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平的影响。方法 体外培养人肾小球足细胞HGPC,分为对照组、高糖组、阿托伐他汀组、PI3K/AKT/FoxO1信号通路抑制剂组、阿托伐他汀+抑制剂组及阿托伐他汀+PI3K/AKT/FoxO1信号通路激活剂组。分别测定细胞增殖、凋亡、迁移能力、炎症因子(TNF-α、IL-6)水平、氧化因子(SOD、MDA)水平及PI3K/AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。结果 10μmol/L阿托伐他汀为干预细胞活力的最佳浓度。高糖组细胞增殖率、SOD水平降低,凋亡率、迁移率、TNF-α、IL-6、MDA水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-FoxO1/FoxO1比值升高;阿托伐他汀组和抑制剂组细胞增殖率、SOD水平升高,凋亡率、迁移率、TNF-α、IL-6、MDA水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-FoxO1/FoxO1比值降低;阿托伐他汀+抑制剂组细胞上述指标趋势进一步加大,而阿托伐他汀+激活剂组趋势与之相反。结论 阿托伐他汀可通过抑制PI3K/AKT/FoxO1通路促进高糖诱导的足细胞增殖,抑制细胞凋亡、迁移、炎症及氧化应激损伤。

南非草药蝴蝶亚仙人掌对db/db小鼠肝脏糖脂代谢和PI3K/Akt/FoxO1信号通路的影响

目的:观察南非草药蝴蝶亚仙人掌(HG)对糖尿病db/db小鼠糖脂代谢的影响,基于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头转录因子O亚族1(FoxO1)信号通路探索HG对db/db小鼠肝脏可能的机制。方法:30只db/db小鼠根据空腹血糖随机分为5组:模型组、二甲双胍组(0.195 g·kg^(-1))、HG低剂量组(0.39 g·kg^(-1))、HG中剂量组(0.78 g·kg^(-1))、HG高剂量组(1.56 g·kg^(-1)),每组6只,并设6只m/m小鼠为正常组。正常组和模型组小鼠给予9 mL·kg^(-1)等体积生理盐水灌胃。每周检测各组小鼠体质量、饮食水量及空腹血糖。连续给药6周后取材,测空腹血清胰岛素(FINS)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素(UREA)、肌酐(CREA),取肝脏包埋切片行苏木素-伊红(HE)、过碘酸雪夫(PAS)及油红O染色。免疫组化检测肝脏中PI3K p85、磷酸化(p)-Akt和p-FoxO1的磷酸化蛋白表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肝组织中PI3K、Akt、FoxO1 mRNA的表达变化。结果:给药干预6周后发现,与模型组比较,HG低、中、高剂量组小鼠的空腹血糖均明显下调(P<0.05);HG低、中剂量组胰岛抵抗指数水平均有明显降低(P<0.05);HG低、中、高剂量组均可明显降低TC、TG与LDL表达水平(P<0.05,P<0.01);病理方面,与模型组比较,蝴蝶亚仙人掌可缓解小鼠肝细胞脂肪样变性,减轻肝脏内脂滴体积和含量,并一定程度增加肝脏内糖原颗粒的分布。免疫组化检测发现,与模型组比较,HG低、中、高剂量组PI3K p85蛋白表达均显著增加(P<0.01);HG中、高剂量组p-Akt蛋白表达均明显增加(P<0.05,P<0.01);HG低、中、高剂量组p-FoxO1蛋白表达均明显增加(P<0.05,P<0.01)。基因检测发现,与模型组比较,HG低、中、高剂量组PI3K mRNA均明显升高(P<0.05),HG高剂量组Akt mRNA明显升高(P<0.05),HG低、中、高剂量组FoxO1 mRNA均明显降低(P<0.05)。结论:HG可缓解db/db小鼠糖脂代谢紊乱,可能与其激活肝脏PI3K/Akt/FoxO1信号通路有关。

多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗相关信号通路的研究进展

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种好发于青春期及育龄期女性的涉及诸多因素的内分泌代谢性疾病,临床主要表现为闭经、体胖、多毛痤疮以及妊娠率显著降低,但目前其病因病机尚不清楚。胰岛素抵抗(IR)与多种慢性非传染性疾病(高血压、糖尿病、心脑血管疾病、PCOS等)相关,目前已知磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、肝激酶B1/AMP活化的蛋白激酶、沉默信息调节因子1/叉头框转录因子O1、Toll样因子4/核因子κB信号通路参与了PCOS伴IR(PCOS-IR)的作用机制,因此充分认识PCOS-IR的发病机制在疾病预防中有重要临床意义。

中药复方益糖康颗粒通过AGE-RAGE轴介导SIRT1调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路促进足细胞自噬的机制

目的:通过观察中药复方益糖康(YTK)颗粒对晚期糖基化终末产物(AGE)-晚期糖基化终产物受体(RAGE)轴介导沉默信息调节因子1(SIRT1)调控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路改善糖尿病肾脏疾病(DKD)大鼠足细胞自噬的影响,探讨YTK治疗DKD的可能作用机制。方法:选取8周龄SPF级健康雄性Wistar大鼠96只,使用随机数字表法分为空白组、模型组、YTK高、中、低剂量组(40、20、10 g·kg^(-1))、西药组(氯沙坦片,20 mg·kg^(-1)),采用高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素建立DKD大鼠模型。造模成功后,各组按照相应比例剂量连续给药8周后取材。严格按照试剂盒所示方法检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏组织病理形态学变化;免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、肌间质蛋白(Desmin)、裂孔膜蛋白(Nephrin)的平均积分吸光度值;蛋白免疫印迹法(Western blot)分析DKD大鼠肾组织中滑膜PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、RAGE、SIRT1、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、FoxO1的蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组SOD、GSH-Px、CAT表达水平明显降低,MDA显著升高(P<0.01);大鼠呈现严重肾损现象;足细胞标志蛋白α-SMA、FN、Desmin阳性表达显著增多,Nephrin、足突蛋白质(Podocin)显著下降(P<0.01);肾组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、RAGE、Caspase-3蛋白表达水平显著升高,SIRT1、FoxO1蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,YTK各剂量组大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT水平显著升高,MDA显著下降(P<0.01);肾损程度均发生了不同程度减轻;足细胞标志蛋白α-SMA、FN、Desmin平均积分吸光度值均明显降低,Nephrin、Podocin显著升高(P<0.01);肾组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、RAGE、Caspase-3表达水平显著降低,SIRT1、FoxO1表达水平显著提升(P<0.01)。中药组表现出明显的量效趋势。结论:YTK可能通过AGE-RAGE轴介导SIRT1调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路,改善足细胞自噬,从而减轻肾脏病理损害,减少蛋白尿,保护肾功能,达到延缓DKD进展的目的。且中药组具有量效趋势。

基于Akt/FoxO信号通路探讨熊果酸对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察熊果酸对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响及具体的分子机制。方法:选用人源结直肠癌细胞RKO为研究对象,用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测不同浓度的熊果酸(0、5、10、15、20、25、30μmol·L^(-1))处理RKO细胞的增殖抑制率,计算出24、48 h的半抑制浓度(IC50)。后续实验根据熊果酸处理RKO细胞24 h的IC50,选用2个浓度开展。集落形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测熊果酸处理RKO细胞后的凋亡率及细胞周期阻滞情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测熊果酸作用RKO细胞24 h,RKO细胞中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Raji细胞中Bcl-2、人T淋巴细胞白血病PMA反应基因(Noxa)凋亡蛋白表达情况,细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)、周期蛋白依赖激酶抑制因子1B(p27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)周期相关的蛋白表达情况,以及蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、叉头框蛋白O3a(FoxO3a)、磷酸化FoxO3a(p-FoxO3a)通路蛋白表达情况。结果:与空白组比较,熊果酸组能够抑制RKO细胞的活力(P<0.05,P<0.01),熊果酸组RKO细胞的克隆形成率明显降低(P<0.05,P<0.01),呈现浓度依赖性;与空白组比较,熊果酸组熊果酸组(20μmol·L^(-1))细胞发生了周期阻滞,在合成前期即G0/G1期明显升高(P<0.05);与空白组比较,熊果酸组(15、20μmol·L^(-1))p21、p27蛋白表达增加,CDK4蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),熊果酸组细胞凋亡率升高,熊果酸组(20μmol·L^(-1))凋亡相关蛋白Bax、Noxa表达升高,Bcl-2表达降低(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,熊果酸组(20μmol·L^(-1))下调p-Akt蛋白的表达,且上调p-FoxO3a的表达(P<0.05,P<0.01),Akt和FoxO3a总蛋白无明显变化。结论:熊果酸能够有效抑制结直肠癌细胞RKO的增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与Akt/FoxO途径有关。

电针对糖尿病肥胖大鼠肝脏Akt/FoxO1信号通路的影响

目的:观察电针对Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠肝脏蛋白激酶B(Akt)/叉头框转录因子1(FoxO1)信号通路的影响,探讨电针改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的可能机制。方法:12只雄性2月龄ZDF大鼠以高脂饲料喂养4周制备糖尿病模型,成模后随机分为模型组与电针组,每组6只;6只雄性Zucker瘦型(ZL)大鼠作为空白组。电针组大鼠予电针双侧“足三里”“三阴交”“胃脘下俞”“脾俞”干预,同侧“足三里”“胃脘下俞”连接电针,连续波,频率15 Hz,每次20 min,每日1次,每周6次,共干预4周。比较各组大鼠造模前及干预前后空腹血糖(FBG)水平;采用放射免疫法检测各组大鼠血清胰岛素(INS)、C肽含量,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);HE染色法观察各组大鼠肝脏组织形态;Western blot法检测各组大鼠肝脏Akt、FoxO1、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)蛋白表达。结果:干预前,与空白组比较,模型组、电针组大鼠FBG升高(P<0.01);干预后,与模型组比较,电针组大鼠FBG降低(P<0.01)。与空白组比较,模型组大鼠血清INS和C肽含量、HOMA-IR、肝脏FoxO1和PEPCK蛋白表达升高(P<0.01),肝脏Akt蛋白表达降低(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠血清INS和C肽含量、HOMA-IR、肝脏FoxO1和PEPCK蛋白表达降低(P<0.01),肝脏Akt蛋白表达升高(P<0.01)。模型组大鼠肝细胞结构紊乱,排列散乱,细胞质内出现大量脂质空泡;电针组大鼠肝细胞形态趋于正常,脂质空泡减少。结论:电针能够下调ZDF大鼠空腹血糖、胰岛素抵抗指数,改善肝脏胰岛素抵抗,可能与调控Akt/FoxO1信号通路有关。

丁苯酞对帕金森病伴抑郁小鼠抑郁行为的影响及对黑质纹状体相关信号通路的调节作用

目的观察丁苯酞对帕金森病伴抑郁小鼠抑郁行为的影响及对黑质纹状体区磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头状转录因子O亚族3a(FoxO3a)信号通路关键因子的调节作用,探讨丁苯酞治疗帕金森病抑郁的效果及机制。方法选择C57成年雄性小鼠40只,完全随机分为正常对照组、帕金森病伴抑郁模型组、多巴丝肼治疗组和联合治疗组。正常对照组正常饲养,不给予任何干预。采用腹腔注射1⁃甲基⁃4⁃苯基⁃1,2,3,6⁃四氢吡啶建立帕金森病小鼠模型,采用慢性不可预知温和应激诱导产生帕金森病伴抑郁小鼠模型。多巴丝肼治疗组给予多巴丝肼6.25 mg/kg,1次/d,灌胃7 d;联合治疗组给予多巴丝肼6.25 mg/kg和丁苯酞120 mg/kg,1次/d,灌胃7 d。通过强迫游泳测试、悬尾测试和糖水偏好实验对小鼠的抑郁行为进行评价。蛋白质印迹法检测各组黑质纹状体区PI3K/Akt/FoxO3a信号通路相关磷酸化因子p⁃PI3K、p⁃Akt、p⁃FoxO3a水平。结果帕金森病伴抑郁模型组强迫游泳不动时间及悬尾静止时间长于正常对照组,糖水偏好指数低于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。多巴丝肼治疗组及联合治疗组强迫游泳不动时间及悬尾静止时间短于帕金森病伴抑郁模型组,糖水偏好指数高于帕金森病伴抑郁模型组,以联合治疗组更明显,差异均有统计学意义(均P<0.05)。帕金森病伴抑郁模型组p⁃PI3K、p⁃Akt、p⁃FoxO3a表达水平明显低于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。多巴丝肼治疗组及联合治疗组p⁃PI3K、p⁃Akt、p⁃FoxO3a表达水平高于帕金森病伴抑郁模型组[(0.54±0.02)、(0.60±0.03)比(0.44±0.01),(0.57±0.01)、(0.66±0.02)比(0.44±0.04),(0.61±0.03)、(0.70±0.03)比(0.45±0.02)],以联合治疗组更明显,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论丁苯酞可通过激活黑质纹状体区PI3K/Akt/FoxO3a信号通路改善帕金森病伴抑郁小鼠的抑郁症状。

葛根芩连汤对db/db糖尿病小鼠SIRT1/FoxO1自噬通路的影响

目的:探究葛根芩连汤是否通过调控沉默信息调节因子1(SIRT1)/叉头框蛋白O1(FoxO1)自噬通路减轻db/db糖尿病小鼠胰岛素抵抗。方法:选取SPF级自发性2型糖尿病动物模型db/db小鼠75只及对照db/m小鼠15只予维持饲料喂养1周后检测血糖,随机分为6组,每组15只。正常组(生理盐水0.2 g·kg^(-1))、二甲双胍组(0.2 g·kg^(-1))、葛根芩连汤高、中、低剂量组(31.9、19.1、6.9 g·kg^(-1))及模型组(生理盐水0.2 g·kg^(-1)),连续灌胃给药8周,1次/d,使用罗氏血糖仪检测空腹血糖(FBG),全自动生化分析仪检测血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清空腹胰岛素(INS)水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝脏组织中Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)及SIRT1/FoxO1自噬通路相关蛋白的表达;免疫组化检测肝脏组织中SIRT1、FoxO1、Beclin-1、LC3B蛋白的表达;透射电镜观察肝脏自噬小体形成。结果:与正常组比较,模型组FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平显著升高(P<0.01),肝脏组织SIRT1、Beclin-1、LC3蛋白表达显著升高(P<0.01),FoxO1显著升高(P<0.01),透射电镜显示模型组自噬小体最多;与模型组比较,二甲双胍组、葛根芩连汤低、中、高剂量组血清FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平明显降低(P<0.05,P<0.01),肝脏组织SIRT1、Beclin-1、LC3蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),FoxO1显著降低(P<0.01),透射电镜显示用药组自噬程度有所减轻;与二甲双胍组比较,葛根芩连汤中、高剂量组FBG、FINS、TG水平显著降低(P<0.01),肝脏组织SIRT1、Beclin-1、LC3蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),FoxO1显著降低(P<0.01),葛根芩连汤高剂量HOMA-IR、TC、LDL-C、HDL-C水平明显降低(P<0.05,P<0.01),透射电镜显示葛根芩连汤中、高剂量组自噬小体明显减少。结论:葛根芩连汤可显著改善糖脂代谢紊乱,通过激活SIRT1/FoxO1自噬通路减轻db/db小鼠胰岛素抵抗从而防治2型糖尿病。

基于网络药理学探讨黄芪-葛根药对对T2DM模型大鼠PI3K/Akt/FoxO1信号通路的调节作用

目的:基于网络药理学及实验验证探讨黄芪-葛根(芪葛)药对治疗2型糖尿病(T2DM)的作用机制。方法:借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)平台筛选黄芪、葛根的有效成分及靶点;于各疾病数据库中检索T2DM的相关靶点,提取药物与疾病的共同靶点,利用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析并构建PPI网络图,并利用Cytoscape 3.7.1软件对关键靶点进行网络拓扑学分析。再利用DAVID在线工具对核心靶点进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析以探究其可能的分子机制。以高脂饲料喂养同链脲佐菌素尾静脉注射联合的方式建立糖尿病大鼠模型,分为正常组、模型组、二甲双胍组、芪葛药对高、中、低剂量组,灌胃4周后检测各组大鼠血清空腹血糖,空腹胰岛素(FINS),天冬氨酸氨基转移酶(AST),丙氨酸氨基转移酶(ALT),甘油三酯(TG),总胆固醇(TC),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),糖原,白细胞介素(IL)-6,肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肝脏组织中胰岛素受体底物(IRS)-2,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),蛋白激酶B(Akt),叉头框蛋白O1(FoxO1)蛋白的表达。结果:网络药理学方法筛选出芪葛药对治疗T2DM核心靶点131个,Akt1,丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)1,TNF-α,IL-6等较为关键;KEGG富集分析预测该药对主要通过PI3K/Akt信号通路,TNF信号通路,FoxO信号通路等发挥降糖作用。与模型组比较,芪葛药对高、中剂量组空腹血糖及FINS水平均降低,糖原水平显著升高(P<0.05,P<0.01);芪葛药对高、中、低剂量组AST,ALT,TG,LDL-C显著降低(P<0.05,P<0.01);芪葛药对高、低剂量组TC水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,芪葛药对高、中剂量组IL-6,TNF-α水平显著降低(P<0.05,P<0.01);芪葛药对高剂量组IRS-2,Akt,p-Akt,PI3K,p-PI3K蛋白表达升高,FoxO1蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论:芪葛药对在治疗T2DM上具有多成分-多靶点-多途径的特点,可能通过IL-6,TNF-α等靶点调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路影响胰岛素抵抗、糖原合成、糖异生、葡萄糖转运、炎症及免疫反应等过程对糖尿病进行治疗。

葛根素基于PI3K/AKT/FoxO1信号通路干预多囊卵巢综合征的实验研究

目的探讨葛根素基于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对多囊卵巢综合征的干预作用。方法将78只SPF级健康雌性Wistar大鼠随机分为正常组13只及造模组65只。造模组用来曲唑灌胃建立多囊卵巢综合征模型,正常组给予等量1%羧甲基纤维素灌胃。将造模成功的大鼠随机分为模型组、对照组和低、中、高剂量实验组,每组13只。模型组和正常组均按2 mL·kg^-1的剂量给予皮下注射0.9%NaCl,qd;对照组按2 mL·kg^-1的剂量给予皮下注射0.2 mg·mL^-1利拉鲁肽溶液,qd;低、中、高剂量实验组均按2 mL·kg^-1的剂量分别给予皮下注射25.0,37.5和50.0 mg·mL^-1葛根素溶液,qd。6组大鼠均连续干预21 d。比较6组血清空腹血糖(FBG)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),以及卵巢组织磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)的表达水平。结果低、高剂量实验组和对照组、模型组的血清FBG分别为(4.25±0.11),(3.97±0.12),(3.95±0.10)和(4.63±0.17)mmol·L-1,HOMA-IR分别为(6.33±0.68),(4.37±0.54),(4.33±0.49)和(7.95±0.75),p-PI3K表达水平分别为(0.24±0.03),(0.74±0.08),(0.75±0.07)和(0.18±0.02),p-AKT表达水平分别为(0.22±0.02),(0.58±0.07),(0.59±0.08)和(0.15±0.02),p-FoxO1表达水平分别为(0.21±0.03),(0.53±0.06),(0.52±0.05)和(0.16±0.02),低、高剂量实验组和对照组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论葛根素能有效地降低多囊卵巢综合征大鼠血糖及胰岛素水平,改善胰岛素抵抗,且呈浓度依赖性,其作用可能与激活PI3K/AKT/FoxO1信号通路有关。

慢病毒介导的RNA干扰FOXC2表达对皮肤鳞状细胞癌A431细胞功能影响

目的:探讨慢病毒介导的RNA干扰叉头框C2(FOXC2)表达对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法检测人正常永生化上皮Hecate细胞和皮肤鳞状细胞癌A431细胞中FOXC2 mRNA和蛋白的表达水平。将体外培养的A431细胞分为对照组(正常培养)、NC-shRNA组(LV-NC-shRNA慢病毒感染)和FOXC2-shRNA组(LV-FOXC2-shRNA慢病毒感染),采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹法检测细胞中蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白表达水平。结果:与Hecate细胞比较,A431细胞中FOXC2 mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与对照组比较,NC-shRNA组细胞中FOXC2 mRNA表达水平、细胞存活率、侵袭数目、克隆形成率、细胞凋亡率和FOXC2、p-AKT、CyclinD1、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05);与对照组或NC-shRNA组比较,FOXC2-shRNA组细胞中FOXC2 mRNA表达水平、细胞存活率、侵袭数目、克隆形成率和FOXC2、p-AKT、CyclinD1、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平均明显降低,而细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论:沉默FOXC2表达可抑制皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、侵袭并促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制AKT信号通路活化有关。

黄芪甲苷对2型糖尿病肾病大鼠肾组织PI3K/Akt/FoxO1信号调控的影响

目的:研究黄芪甲苷对2型糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其对磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框转录因子O亚族1(FoxO1)信号的调控作用,探讨黄芪甲苷保护2型糖尿病肾病的机制。方法:6周高糖高脂饮食后,给予链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射(35 mg·kg^-1)建立2型糖尿病大鼠模型,随机分为正常组,模型组,黄芪甲苷(20,40,80 mg·kg^-1)组及盐酸二甲双胍(阳性药)组。连续给药8周后检测各组大鼠体质量,肾脏指数,血糖,24 h尿蛋白,尿微量白蛋白,尿肌酐,血肌酐及血尿素氮含量的变化;苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏组织病理形态学变化;马松(Masson)三色染色观察胶原表达水平;过碘酸六胺银(PASM)染色观察基底膜的变化;免疫组化检测磷酸化FoxO1(p-FoxO1)蛋白表达;蛋白质免疫印迹法(Western blot)分析PI3K/Akt/FoxO1信号蛋白及自噬标记蛋白PI3K,微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅰ/Ⅱ,B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)/腺病毒E1B 19 k Da相互作用蛋白3(BNIP3),Beclin1,p-Akt,Akt表达水平。结果:与正常组比较,模型组肾小球基底膜增厚,细胞外基质增多,系膜扩张,胶原蛋白显著增加,PI3K/Akt/FoxO1信号增强(P <0. 01),自噬活性减弱(P <0. 01);与模型组比较,黄芪甲苷中、高剂量肾脏组织病变明显改善,明显抑制肾组织PI3K,Akt及FoxO1磷酸化水平(P <0. 05,P <0. 01),同时增强自噬反应,上调BNIP3,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1的表达(P <0. 05,P <0. 01)。结论:黄芪甲苷可能通过抑制PI3K/Akt/FoxO1信号增加肾组织细胞自噬活性,减缓了2型糖尿病肾病的发展进程。

基于PI3K/Akt通路探讨首乌丸对D-半乳糖衰老大鼠海马神经元凋亡的影响

目的:探讨首乌丸通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路对D-半乳糖衰老大鼠海马神经元凋亡的影响。方法:将SPF级SD雄性大50只随机分为正常组、模型组、维生素E组、首乌丸中剂量组及首乌丸高剂量组,除正常组外,其余4组均用D-半乳糖(120 mg·kg^(-1))制造衰老模型,同时首乌丸中、高剂量组用首乌丸(1.08、2.16 g·kg^(-1))进行灌胃,维生素E组予以维生素E(0.018 g·kg^(-1))灌胃。造模6周后取全脑、海马组织,尼氏染色观察海马神经元形态学变化,原位末端标记法(TUNEL)检测海马细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),磷酸化(p)-PI3K,蛋白激酶B(Akt),p-Akt、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、叉头框蛋白O3a(FoxO3a)、p-FoxO3a、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测海马FoxO3a mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠海马神经元凋亡阳性细胞明显增多,凋亡指数显著升高(P<0.01),海马CA1区尼氏染色显示海马神经元丢失、排列稀疏,尼氏体数量减少,存在尼氏体固缩和深染,p-PI3K、p-Akt、Caspase-3蛋白相对表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著升高(P<0.01),FoxO3a、p-FoxO3a蛋白相对表达、p-FoxO3a/FoxO3a显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01),Bax蛋白表达显著升高(P<0.01),FoxO3a mRNA表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,经首乌丸治疗后,凋亡阳性细胞明显减少,细胞凋亡指数显著降低(P<0.01),海马CA1区尼氏染色显示各治疗组神经元丢失好转,尼氏体增多,排列较密集,大鼠PI3K、Akt蛋白表达差异无统计学意义,首乌丸中、高剂量组的p-PI3K、p-Akt、Caspase-3蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著降低,FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表达、p-FoxO3a/FoxO3a显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.01),Bax蛋白表达显著降低(P<0.01),Foxo3a mRNA表达显著升高(P<0.01)。结论:首乌丸能够改善海马神经元组织结构,抑制PI3K/Akt信号通路,下调Caspase-3蛋白表达,激活FoxO3a,上调Bcl-2,下调Bax,上调Bcl-2/Bax,从而减少神经元细胞凋亡。

基于网络药理学和体内实验的抗衰老片抗衰老作用及机制探讨

目的基于网络药理学和体内实验探讨抗衰老片抗衰老的作用机制。方法利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选抗衰老片中组方药材的主要化学成分及其靶点,并通过文献检索、Pubchem对抗衰老片中药材的主要成分进行补充,经SwissTargetPrediction数据库预测靶点;通过GeneCards、OMIM数据库获取衰老相关靶点;通过Venny2.1.0平台获得抗衰老片成分与衰老的共同靶点;基于STRING数据库和Cytoscape 3.8.0软件构建药物与疾病共同靶点的蛋白质相互作用网络(PPI);基于R语言进行基因本体(GO)生物功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。以秀丽隐杆线虫为实验对象,观察抗衰老片对N2野生型秀丽隐杆线虫寿命及百草枯诱导的N2野生型线虫及突变体CB1370、CF1038、MQ1333、MQ887、TJ1052寿命的影响,探究抗衰老片抗衰老的作用及潜在的作用机制。结果筛选出抗衰老片221个活性成分和1232个预测靶点,衰老相关靶点12081个,抗衰老片成分和疾病的共同靶点1020个。KEGG富集分析结果主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路、晚期糖基化终末产物/晚期糖基化终末产物受体(AGE/RAGE)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等。线虫实验结果表明,抗衰老片可延长正常情况下及百草枯诱导下的N2野生型秀丽隐杆线虫的寿命,提高秀丽隐杆线虫对百草枯的耐性;与相应各对照组相比,抗衰老片无法延长突变体TJ1052和CF1038在氧化应激下的寿命,但突变体CB1370、MQ1333和MQ887在氧化应激下的寿命可被延长。结论抗衰老片对秀丽隐杆线虫具有延长寿命的作用,其潜在的机制可能依赖于PI3K信号通路和叉头转录因子(FOXO)信号通路,而不依赖于胰岛素受体信号通路和线粒体相关信号通路。

天花粉-黄精药对对糖尿病小鼠糖脂代谢及肝脏胰岛素抵抗的影响

目的:观察不同配伍比例的天花粉-黄精药对水提物对自发性2型糖尿病小鼠(KKAy小鼠)糖脂代谢的影响,并基于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头转录因子1(FoxO1)信号通路探讨天花粉-黄精药对改善胰岛素抵抗的作用机制。方法:取雄性8周龄C57BL/6J小鼠为正常组,将同周龄KKAy雄性小鼠根据血糖、体质量随机分为模型组、二甲双胍组、天花粉-黄精药对1∶1组(天花粉30 g、黄精30 g),天花粉-黄精药对1∶3组(天花粉15 g、黄精45 g),天花粉-黄精药对1∶5组(天花粉10 g、黄精50 g),每组各6只。给药8周,分别于第2周、第4周、第6周、第8周取相同时间点记录小鼠体质量(BW)、空腹血糖(FBG),第7周进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)。用药结束后,检测各组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平、空腹血清胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMAIR);肝脏组织进行苏木素-伊红(HE)染色和过碘酸-Schiff(PAS)染色,观察肝脏脂肪分布和糖原含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝脏PI3K、Akt、FoxO1蛋白及其磷酸化蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠进食量、空腹血糖、耐糖量、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C显著升高(P<0.01),PI3K、Akt、FoxO1蛋白及其磷酸化蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,天花粉-黄精药对水提物各配伍组能明显降低KKAy小鼠空腹血糖及胰岛素抵抗指数(P<0.05,P<0.01),尤以天花粉、黄精为1∶3配伍组最为显著(P<0.01),效果相当于二甲双胍;天花粉-黄精药对水提物各配伍组能明显降低小鼠OGTT各时间点血糖(P<0.05);并能显著降低各组小鼠TC、LDL-C(P<0.01),1∶3组可显著降低小鼠TG(P<0.01);各配伍组BW、FINS有下降,但差异无统计学意义。各给药组小鼠肝脏形态较规则,脂滴较少,糖原分布较多;Western blot结果显示天花粉-黄精药对组肝脏PI3K、磷酸化(p)-Akt蛋白表达增加,FoxO1蛋白表达抑制、磷酸化水平增加(P<0.05)。结论:天花粉-黄精药对水提物可有效降低KKAy小鼠FBG及TC、LDL-C,HOMA-IR,尤以天花粉-黄精为1∶3配伍比例最佳,并促进肝脏糖原合成,减少脂肪变性,其作用机制可能与调节肝脏PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关。

槲皮苷对帕金森病细胞模型中PC12细胞的保护作用

目的研究槲皮苷在帕金森病(PD)细胞模型中对PC12细胞的保护作用及其机制。方法通过6-羟基多巴胺氢溴酸盐(6-OHDA)处理PC12细胞构建PD细胞模型。实验分为A,B,C和D组。A组加入0μmol·L^-16-OHDA和0μmol·L^-1槲皮苷;B组加入200μmol·L^-16-OHDA和0μmol·L^-1槲皮苷;C组加入200μmol·L^-16-OHDA和100μmol·L^-1槲皮苷;D组加入200μmol·L^-16-OHDA和200μmol·L^-1槲皮苷。用噻唑蓝法研究槲皮苷对6-OHDA处理后PC12细胞活性的影响,用TUNEL实验研究槲皮苷对细胞凋亡的影响,用蛋白质免疫印迹法研究槲皮苷对细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头转录因子O亚型3a(FoxO3a)信号通路的影响。结果槲皮苷可显著增加6-OHDA处理后PC12细胞活性,降低PC12细胞凋亡率,激活PI3K/Akt/FoxO3a信号通路并抑制细胞凋亡通路。结论槲皮苷通过激活PI3K/Akt/FoxO3a信号通路,提高6-OHDA处理后神经细胞活性,降低凋亡水平,为神经细胞提供保护。