间充质干细胞外泌体调节哺乳动物雷帕霉素靶点/p70核糖体蛋白S6激酶/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白通路改善糖尿病肾病大鼠肾损伤的机制研究

目的探讨间充质干细胞外泌体(MSC-EVs)通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(S6K1)/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白(Beclin 1)通路改善糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的机制。方法采用高脂饮食联合腹腔链脲佐菌素(STZ)注射的方法建立SD大鼠DN模型,随机分为模型组、MSC-EVs组、MSC-EVs+MHY1485(mTOR激活剂)组,每组12只。另取12只SD大鼠以正常饲料喂养6周后,腹腔注射同等剂量柠檬酸钠溶液作为对照。以MSC-EVs和MHY1485分组处理后,检测大鼠血糖及肾功能指标[血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿微量白蛋白(UmALB)]水平。采用苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠肾组织病理形态;采用免疫组化检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路相关蛋白表达;采用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路及自噬相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠肾组织形态发生损伤,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,MSC-EVs组大鼠肾组织形态损伤减轻,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著升高(P<0.05);与MSC-EVs组相比,MSC-EVs+MHY1485组大鼠肾组织形态损伤加重,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05)。结论MSC-EVs可增强自噬,降低DN大鼠血糖、SCr、BUN和尿蛋白水平,减轻肾组织损伤,其机制可能与抑制mTOR/S6K1/Beclin 1通路激活有关。

长链非编码RNA HCG22调控蛋白激酶B/P70S6激酶通路对胃癌细胞生物学行为的影响

目的探讨长链非编码RNA HCG22(lncRNA HCG22)对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制。方法实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测正常胃上皮细胞GES-1和胃癌MGC-803、SGC-7901细胞lncRNA HCG22的表达;采用慢病毒过表达和对照载体感染MGC-803细胞, 分为过表达组(LV-HCG22-OE)、对照组(LV-NC)和空白组(Blank);细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测24、48、72 h的吸光度值, 集落形成实验检测细胞集落形成率;划痕愈合实验检测迁移能力;流式细胞术分析周期和凋亡;免疫荧光观察半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)荧光;蛋白质印迹法(Western blot)检测凋亡蛋白、自噬标志物以及蛋白激酶B(Akt)/P70S6激酶(P70S6K)通路蛋白的变化。两组间比较采用t检验。结果 lncRNA HCG22在MGC-803(0.026±0.011)和SGC-7901的表达(0.048±0.012)低于GES-1细胞(1.000±0.123, t=7.871、7.694, P<0.01)。上调lncRNA HCG22后, 抑制细胞的增殖能力, LV-HCG22-OE组的吸光度值低于LV-NC组(24 h为0.295±0.015比0.501±0.014, 48 h为0.526±0.012比0.952±0.048, 72 h为0.929±0.016比1.381±0.020, t=10.170、8.614、17.800, P<0.01);集落形成率[(36.250±2.000)%比(53.880±3.375)%, t=4.493, P<0.05]和迁移能力均低于LV-NC组[24 h为(32.940±1.315)%比(50.220±1.120)%, 36 h为(63.970±1.500)%比(79.650±1.000)%, t=10.010、8.698, P<0.05]。LV-HCG22-OE组G2/M期细胞比例增加, G1期减少;细胞凋亡率增加(17.980±3.120比3.667±0.997, t=4.372, P<0.05)。共聚焦显微镜观察到Caspase-3荧光信号增加, Western blot结果显示, LV-HCG22-OE组B细胞淋巴瘤因子-xL(bcl-xL)和p62蛋白水平低于LV-NC组(t=7.686、5.376, P<0.05), B细胞淋巴瘤因子-2相关X蛋白(bax), 微管相关蛋白1轻链3B(LC3-Ⅱ)蛋白水平高于LV-NC组(t=9.311、4.768, P<0.05);LV-HCG22-OE组磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化P70S6激酶(p-P70S6K)蛋白水平低于LV-NC组(p-Akt/Akt为0.426±0.085比0.891±0.012, t=5.395, P<0.05;p-P70S6K/P70S6K为0.605±0.019比1.027±0.072, t=5.639, P<0.05)。结论 lncRNA HCG22可能通过Akt/P70S6K信号通路抑制MGC-803细胞增殖、迁移, 诱导周期阻滞, 促进凋亡和自噬。

丝/苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70 S6K信号通路在口腔鳞癌中的表达及临床意义

目的探讨丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70 S6K信号通路在口腔鳞癌组织中的表达情况,为口腔鳞癌的早期诊断和治疗提供参考。方法收集口腔鳞癌标本51例,癌旁黏膜组织10例,正常口腔黏膜10例。采用免疫组织化学SP法检测口腔鳞癌、癌旁黏膜组织及正常口腔黏膜中p-Akt、p-mTOR及p70S6K的表达情况,分析三者相互之间表达的相关性。结果 p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌组中的表达显著高于正常口腔黏膜组和癌旁黏膜组的表达。p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌的表达与患者的年龄、性别及临床分期无相关性,但与口腔鳞癌的分化程度及有无淋巴结转移有相关性。p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌的表达相互之间具有较强的正相关关系。结论 Akt/mTOR/p70 S6K信号通路分子在口腔鳞癌中表达活跃,提示可能与口腔鳞癌的发生发展具有重要的相关性。

核糖体S6蛋白激酶p90^(rsk)与卵母细胞减数分裂

丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号途径对减数分裂有重要调节作用 ,p90 rsk是迄今研究最清楚的MAPK下游靶分子 ,介导MAPK途径在卵母细胞减数分裂中的多种功能 ,包括卵母细胞减数分裂的启动、MⅠ /MⅡ期转化和MⅡ期阻滞的维持等 .p90 rsk的磷酸化是MAPK激活的结果 ,而细胞退出减数分裂时 ,p90 rsk的去磷酸化也发生在MAPK失活以后 .介绍了在卵母细胞中 p90 rsk的研究进展 .

胰岛素和佛波酯在蛋白质合成中经不同途径激活p70 S6激酶

为研究佛波酯 (PMA)和胰岛素在蛋白质合成中的信号传递 ,应用激酶活性测定和Western印迹等方法 ,分别检测mTOR(mammaliantargetofrapamycin)特异性抑制剂rapamycin或磷脂酰肌醇 3激酶 (PI3K)的特异性抑制剂LY2 94 0 0 2预处理、PMA或胰岛素处理的血清饥饿的中国仓鼠肺成纤维细胞 (CHL)中p70S6激酶 (p70S6K)和蛋白激酶B(PKB)的活性及表达 .结果显示 ,PMA或胰岛素刺激促进p70S6K的活化和表达 .而rapamycin预处理可阻断PMA和胰岛素对p70S6K的激活作用 ,表明PMA和胰岛素可能是通过mTOR 依赖性途径激活p70S6K .结果还显示 ,胰岛素刺激促进PKB的活化和表达 ,而PMA对PKB的活性和表达无影响 .LY2 94 0 0 2预处理可阻断胰岛素对p70S6K和PKB的激活作用 ,但不能抑制PMA刺激引起的p70S6K的活化 .表明胰岛素和PMA介导p70S6K活化的信号途径有所不同 ,胰岛素介导p70S6K的活化可能依赖于PI3K途径 。

p90核糖体S6蛋白激酶家族与恶性肿瘤

p90核糖体S6蛋白激酶(ribosomal S6 kinase,RSK)为Ras信号转导通路下游途径的重要调控因子,对Ras通路起调控作用。近年发现RSK家族与恶性肿瘤发生、发展密切相关。本文就RSK家族与恶性肿瘤的关系作简要综述。

mTOR/P70S6激酶信号通路在腮腺腺癌发生中的作用

目的 :研究mTOR/P70S6激酶信号通路激活在腮腺腺癌发生中的作用。方法 :用免疫组织化学方法及Western印迹分析测定腮腺腺癌中mTOR和P70S6激酶的表达。结果 :免疫组化与Western印迹分析的结果一致 ,与正常组织相比 ,腮腺腺癌中mTOR和P70S6激酶的表达明显增加。结论

P70 S6激酶在腮腺腺泡细胞癌中表达的研究

目的:研究P70S6激酶信号通路在腮腺腺泡细胞癌中的作用。方法:用免疫组化方法、Westen印迹分析测定腮腺腺泡细胞癌中P70S6激酶的表达。结果: 免疫组化的结果与Westen印迹分析一致,和正常组织相比,腮腺腺泡细胞癌中P70S6K的表达明显增加。结论:P70S6K的表达增加是提示腮腺腺泡细胞癌发生的重要生物化学指标。

基于mTOR-p70S6K/4EBP1信号通路探讨淫羊藿苷抑制病毒性心肌炎模型小鼠心肌损伤的实验研究

目的探讨淫羊藿苷对病毒性心肌炎小鼠雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)/真核细胞起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)信号通路的影响。方法健康雄性BALB/c小鼠65只,分为对照组(n=11)和模型组(n=54)。模型组采用柯萨奇病毒B3标准株腹腔接种建立病毒性心肌炎小鼠模型,对照组给予等体积不含病毒的培养液腹腔注射。将造模成功的小鼠随机分为模型组(n=11)、淫羊藿苷低浓度组(n=12)、淫羊藿苷高浓度组(n=12)和卡托普利组(n=11)。模型组与对照组分别予以0.5%羧甲基纤维素钠;淫羊藿苷低、高浓度组分别予以8、16 mg/mL淫羊藿苷混悬液;卡托普利组予以10 mg/mL卡托普利混悬液;各组药物灌胃剂量均为10 mL/kg,每日1次,连续干预60 d。检测比较各组小鼠心脏超声指标,心肌组织病理评分,心肌胶原容积分数(CVF),血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前胶原氨基端原肽(PⅢNP)、转化生长因子β1(TGF-β1)含量,以及心肌组织磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)表达水平。结果干预后,与模型组比较,各组小鼠左室收缩末期内径(LVEDs)、左室舒张末期内径(LVEDd)较低,左室内径缩短率(FS)水平较高,心肌组织病理学评分较低,心肌CVF较低,血清PⅠCP、PⅢNP、TGF-β1含量较低,心肌组织p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1表达水平较低,差异有统计学意义(P<0.05),且淫羊藿苷干预组呈一定量效关系。结论淫羊藿苷能剂量依赖性地改善病毒性心肌炎小鼠心脏收缩舒张功能,减轻心肌组织病理损伤,延缓心肌纤维化,其作用可能与抑制mTOR-p70S6K/4EBP1信号通路活性有关。

瘦素、胰岛素及IGF-2影响滋养层细胞中PKB和P70S6K蛋白表达的机制

目的:探讨瘦素、胰岛素及IGF-2对滋养层细胞中PKB和P70S6K蛋白表达的影响是否与PI3K/PKB/mTOR信号途径存在联系。方法:应用Western blot检测瘦素、胰岛素及IGF-2作用后滋养层细胞中PKB和P70S6K蛋白的表达,以及分别加入PI3K的特异性抑制剂LY294002和mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素后对PKB和P70S6K蛋白表达的影响。结果:瘦素、胰岛素及IGF-2刺激组滋养层细胞中PKB和P70S6K蛋白表达与对照组相比明显增加(P<0.05)。瘦素、胰岛素及IGF-2刺激组分别加入LY294002和雷帕霉素,PKB和P70S6K蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:瘦素、胰岛素及IGF-2可能通过PI3K/PKB/mTOR信号通路促进滋养层细胞中PKB和P70S6K蛋白表达。

基于mTOR/P70S6K通路研究上调miR-205-5p对肝癌细胞增殖、侵袭的影响

目的基于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体S6蛋白激酶(P70S6K)通路研究上调微小核糖核酸(miR)-205-5p对肝癌细胞增殖、侵袭的影响。方法肝癌HepG2细胞株经过细胞培养、转染后,分为上调miR-205-5p组、肝癌组和阴性对照组。实时荧光定量(RT)-聚合酶链反应(PCR)检测miR-205-5p表达,观察肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力,Western印迹检测p-mTOR、p-P70S6K、mTOR、P70S6K蛋白表达。结果上调miR-205-5p组miR-205-5p表达显著高于肝癌组和阴性对照组,阴性对照组显著高于肝癌组(均P<0.05)。在24、48、72 h,上调miR-205-5p组细胞光密度值均显著低于阴性对照组和肝癌组,阴性对照组光密度值均显著低于肝癌组,在72 h差异表现最为明显(P<0.05),阴性对照组和肝癌组随着时间延长,光密度值逐渐显著升高,上调miR-205-5p组光密度值逐渐显著降低(均P<0.05)。上调miR-205-5p组72 h细胞增殖数、细胞侵袭数显著低于肝癌组和阴性对照组,细胞凋亡数显著高于肝癌组和阴性对照组(均P<0.05)。上调miR-205-5p组mTOR、P70S6K、p-mTOR、p-P70S6K蛋白表达显著低于肝癌组和阴性对照组(均P<0.05)。结论上调miR-205-5p可以影响mTOR/P70S6K信号通路的活性,参与肝癌细胞侵袭、增殖、凋亡的过程。

淀粉样β蛋白片段25~35下调大鼠海马PI3K/Akt/p70S6K信号传导通路(英文)

目的探讨阿尔茨海默病(AD)的淀粉样β蛋白(Aβ)的沉积是否损害神经细胞存活的信号传导通路。方法实验分为生理盐水对照组;Aβ25-35组;Aβ25-35+布洛芬组;Aβ25-35+布洛芬+LY294002组;Aβ25-35+LY294002组。大鼠分别灌胃给予布洛芬7.5或15 mg.kg-1,每日1次,连续3周后,左侧脑室内注射Aβ25-35(10 μL, 1 mmol.L-1),之后继续灌胃给予布洛芬1周。PI3K特异性阻断剂LY294002 (5 μL, 4 mmol.L-1)在注射Aβ25 -35前1 h左侧脑室内注射。注射Aβ25-35后1周,取海马CA1区,Western免疫印迹法观察P53,Bax, FasL, Bcl-2, Akt和p70S6K的蛋白表达水平。应用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3活性测定试剂盒分析caspase 3活性变化,RT-PCR方法观察p70s6k mRNA表达水平。结果脑室内注射Aβ25-35可引起大鼠海马CA1区磷酸化Akt/PKB和磷酸化p70S6K表达明显降低,分别从对照组1.32±0.14和0.769±0.028下降到0.69±0.08和0.479±0.032。同时,海马CA1区促凋亡蛋白P53, Bax和FasL表达及caspase 3活性明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低。预先注射LY294002可使caspase 3活性较单独注射Aβ25-35组进一步增加。给Aβ25-35前后连续给予布洛芬4周可明显对抗Aβ25-35引起的上述变化。LY294002可明显减弱布洛芬上调磷酸化Akt/PKB和磷酸化p70S6K表达的作用。结论 Aβ25-35引起抗凋亡通路PI3K/Akt/p70S6K下调可能参与AD的神经元损伤。布洛芬具有较好的对抗作用,这可能与上调PI3K/Akt/p70S6K通路中的一些蛋白有关。

miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制研究

目的探讨miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制。方法采用人宫颈癌HeLa细胞株构建宫颈癌大鼠模型,分为Gg组(宫颈癌大鼠)、Gm组(注射miR-10b-mimics)、Gi组(注射miR-10b-inhibitions)。采用HE染色观察癌组织变化,Western blotting、RT-PCR检测mTOR/P70S6K的mRNA和蛋白表达水平,Transwell检测HeLa细胞的侵袭能力。结果Gg组肿瘤组织出现丰富的血供,界限分明,切面呈鱼肉状,肿瘤细胞大小较为均等;Gm组肿瘤组织中有大量纤维血管形成,肿瘤细胞大小不等,胞浆着色较深;Gi组肿瘤组织中纤维血管较少,胞浆着色稍浅。Western blotting结果显示,mTOR/P70S6K蛋白表达水平为Gm组<Gg组<Gi组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,mTOR/P70S6K mRNA水平为Gi组>Gg组>Gm组(P<0.05),miR-10b mRNA水平为Gi组<Gg组<Gm组(P<0.05)。Transwell结果显示,肿瘤细胞侵袭能力为Gi组>Gg组>Gm组(P<0.05)。结论miR-10b过表达可激活mTOR蛋白,增加P70S6K活性,抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移,有望成为宫颈癌治疗的新靶点。

补肾解毒法对HBV感染免疫耐受期产妇脐带血浆细胞样树突状细胞中PI3K、mTOR、p70S6K、IFN-α表达的影响

目的:研究补肾解毒法对HBV感染免疫耐受期产妇脐带血浆细胞样树突状细胞(pDCs)中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70核糖体S6蛋白激酶(p70S6k)、干扰素-α(IFN-α)表达的影响。方法:收集HBV感染免疫耐受期产妇脐带血10例,分离培养pDCs。同时制备补肾方、解毒方、补肾解毒方含药血浆及无药血浆。将培养至第7天的pDCs随机分为5组,即补肾组、解毒组、补肾解毒组、无药血浆组及空白组,干预48 h后,分别收集细胞及上清液,实时PCR检测pDCs PI3K、mTOR、p70S6K mRNA的表达,Western Blot技术检测pDCs PI3K、mTOR、p70S6K蛋白表达,ELISA检测pDCs培养上清IFN-α水平。结果:补肾方和补肾解毒方能提高HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA、蛋白及IFN-α的表达,以补肾解毒方更明显,而解毒方不能明显提高HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA、蛋白及IFN-α的表达。结论:补肾解毒方能明显提高HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA、蛋白的表达,使IFN-α分泌增加,改善HBV感染患者pDCs的功能。

基于mTOR/p70S6K信号通路探究紫丁香苷对高糖诱导的小鼠足细胞MPC5损伤的影响

目的:探究紫丁香苷对高糖诱导的小鼠足细胞MPC5损伤及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)信号通路的影响。方法:将小鼠足细胞MPC5分为:对照组(5.5mmoL/L葡萄糖)、高糖诱导组(30mmoL/L葡萄糖)、紫丁香苷低浓度组(2.5μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)、紫丁香苷中浓度组(5μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)、紫丁香苷高浓度组(10μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)。各组向RPMI 1640培养基中加入上述浓度的相应试剂或药物,培养72h。酶标仪测定各组MPC5细胞吸光度值,计算细胞活力;流式细胞仪测定各组MPC5细胞凋亡情况;鬼笔环肽染色观察各组MPC5细胞骨架形态;荧光定量PCR和蛋白印迹法分别测定各组MPC5细胞mTOR、p70S6K信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表达。结果:对照组MPC5细胞骨架形态正常,细胞长轴呈线性分布,荧光染色明显;与对照组比较,高糖诱导组MPC5细胞骨架断裂,细胞萎缩,荧光染色黯淡,吸光度值、细胞活力显著降低,凋亡率、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与高糖诱导组比较,紫丁香苷低、中、高浓度组MPC5细胞骨架结构恢复清晰,荧光强度逐渐变亮,足突趋于明显,吸光度值、细胞活力依次升高,凋亡率、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达水平依次降低(P<0.05)。结论:紫丁香苷对高糖诱导的MPC5细胞损伤具有保护作用,能明显促进MPC5细胞增殖,抑制其凋亡;其机制可能与紫丁香苷抑制高糖状态下MPC5细胞中mTOR/p70S6K通路的激活有关。

rhGLP-1(7-36)对人肝HL-7702细胞系Akt、P70S6K蛋白的影响

目的观察重组人胰高血糖素样肽-1(7-36)[recombinant human glucagon like peptide-1(7-36),rhGLP-1(7-36)]对人肝HL-7702细胞系蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,P70S6K)表达的影响,探讨其作用机制。方法选用处于对数生长期的人肝HL-7702细胞系,实验组用含100 nM浓度rhGLP-1(7-36)的培养基分别处理0 min、10 min、60 min、90 min;对照组用不含100 nM浓度rhGLP-1(7-36)的培养基分别处理相同的时间。用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)分别检测各组Akt蛋白、P70S6K蛋白的表达水平。结果与对照组相比,实验组10 min、60 min、90 min时Akt蛋白、P70S6K蛋白的表达水平无明显变化;10 min、60 min、90 min时p-AktThr308蛋白、p-AktSer473蛋白及磷酸化P70S6K蛋白表达水平均升高,其中,10 min、60 min时差异无统计学意义(P>0.05),90 min时差异有统计学意义(t=-5.596,P=0.011;t=-5.405,P=0.012;t=-5.597,P=0.011)。结论 rhGLP-1(7-36)促进肝脏细胞中Akt蛋白和P70S6K蛋白的磷酸化与时间有关,该结果为研究GLP-1对肝细胞的直接作用提供依据。

mTOR/p70S6K信号通路与NIH3T3成纤维细胞增殖

[目的]探讨mTOR/p70S6K信号通路激活在成纤维细胞增殖中的作用。[方法]以mTOR基因转染小鼠NIH3T3成纤维细胞,用MTT法检测其是否增殖,用RT-PCR和Western印迹分析测定细胞mTOR、p70S6KmRNA与蛋白的表达。[结果]MTT法检测转染组细胞增殖能力增强;RT-PCR与Western印迹分析转染组中mTOR和p70S6K的mRNA与蛋白表达水平明显增加(P﹤0.01)。[结论]mTOR/p70S6K信号通路激活可能介导成纤维细胞增殖。

食管鳞状细胞癌组织中RSK4、p63的表达变化及意义

目的探讨食管鳞状细胞癌(鳞癌)组织中核糖体S6蛋白激酶4(RSK4)、p63的表达变化及意义。方法收集食管鳞癌活检标本72例份,应用免疫组织化学EnVision两步法检测癌组织中RSK4、p63蛋白表达,染色结果采用半定量分析。选取食管鳞状细胞癌细胞系TE-11、TE-10及正常食管细胞Het-1A,分别采用qRT-PCR法、Western blotting法检测RSK4、p63 mRNA及蛋白表达。采用Kaplan-Meier法及Cox风险回归模型对患者进行生存分析。结果食管鳞状细胞癌组织中RSK4蛋白阳性表达率为62.5%(45/72),p63蛋白阳性表达率为83.3%(60/72)。食管鳞状细胞癌细胞系(TE-11、TE-10)中RSK4、p63基因的mRNA和蛋白表达均高于正常食管细胞Het-1A(P均<0.05)。Kaplan-Meier法生存分析结果显示,RSK4阳性表达与食管癌患者预后不良相关(P<0.05),且分期、组织分化程度、淋巴结转移等均是影响患者生存期的因素(P均<0.05);p63表达与患者临床病理特征及预后均无关(P均>0.05)。Cox回归模型分析结果显示,RSK4阳性表达、pT分期、组织分化程度、淋巴结转移与食管癌患者生存有关(P均<0.05)。结论RSK4与p63在食管鳞状细胞癌组织中呈异常表达,RSK4可作为潜在食管癌分期的分子标志物及预后评估因子。

1,25(OH)_2D_3对人肾小球系膜细胞增殖及mTOR/p70s6K表达的影响

目的：探讨1,25-二羟基维生素D3[1,25（OH）2D3]对人肾小球系膜细胞增殖的影响及其在肾小球系膜细胞调控中对mTOR/p70s6K信号通路的作用。方法体外培养人肾小球系膜细胞，取传代培养至3～7代细胞分为4组：正常对照组（加含5%胎牛血清DMEM培养基），VD组[加1,25（OH）2D310-8 mol/L]，R组（加雷帕霉素5 mg/L），R＋VD组[加雷帕霉素5 mg/L及1,25（OH）2D310-8 mol/L]，干预48 h。采用细胞增殖与活性检测试剂盒CCK-8检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期时相分布，免疫荧光法检测细胞中mTOR、p70s6K的表达情况。结果正常对照组、VD组、R组、R＋VD组：（1）吸光度值（A450）依次降低，组间多重比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；抑制率（IR）依次升高。（2）G1期细胞比例依次增加，S期、G2/M期依次减少，增殖指数（PI）依次降低，除R组与VD组比较差异无统计学意义外，其余组间多重比较差异均有统计学意义。（3）系膜细胞中mTOR、p70s6K蛋白表达强度均依次降低，除R组与VD组比较差异无统计学意义外，其余组间多重比较差异均有统计学意义。结论1,25（OH）2D3可显著抑制人系膜细胞增殖，且其可能通过抑制mTOR/p70s6K信号通路调控肾小球系膜细胞增殖。

GSK-3及P70S6K在胰岛素抵抗大鼠肌肉中的表达及意义

目的:观察饮食诱导的胰岛素抵抗(IR)大鼠骨骼肌中糖原合成酶-3(GSK-3)及核糖体S6蛋白激酶(P70S6K)的表达及变化情况,并探讨GSK-3和P70S6K在IR发生中的作用及意义。方法:将40只4周龄Wistar大鼠随机分为正常对照组、高糖组、高脂组、高脂高糖饲养组,喂养8周后用高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术(钳夹试验)对大鼠进行胰岛素敏感性的评估,采用Westernblot法检测各组大鼠骨骼肌中GSK-3及P70S6K的含量,同时测定各组大鼠的附睾脂肪垫重量、血糖(BG)、胰岛素(INS)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)及游离脂肪酸(FFA)水平、超敏C反应蛋白(hsCRP)。结果:高脂高糖组、高脂组大鼠产生明显IR,体重增加(P<0.01),以附睾脂肪垫的重量增加更为显著(P<0.01),TG、TC及FFA水平、hsCRP增加(P<0.01),GSK-3、P70S6K在IR大鼠肌肉中的表达明显升高。结论:高脂高糖饮食可诱导大鼠产生IR,IR大鼠的hsCRP、TG、TC及FFA水平明显增高,大鼠产生IR与炎症反应有关,GSK-3、P70S6K在IR大鼠中的表达明显升高,在胰岛素信号传导中起负相调节作用。