补阳还五汤对大鼠脑缺血后蛋白激酶B1和c—Jun氨基末端激酶1／2表达的影响

目的探讨补阳还五汤对脑缺血后大鼠蛋白激酶B1（AKT1）和c-Jun氨基末端激酶1/2（JNK1/2）的影响。方法将48只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、模型组、补阳还五汤组，每组12只。采用大脑中动脉闭塞法（MCAO）建立右侧局灶性脑缺血大鼠模型。补阳还五汤组大鼠于术后2h起灌服补阳还五汤（主要由生黄芪120g、当归6g、赤芍4.5g、川芎3g、西红花3g、桃仁3g、广地龙3g组成）14.2 g/kg，每日1次，连续7 d。其他各组动物均给予等体积生理盐水。于第7日处死大鼠，取脑组织，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定AKT1 mRNA表达，采用免疫组化法检测JNK1/2蛋白表达。结果与正常对照组和假手术组比较，模型组AKT1 mRNA表达量〔吸光度（A）值〕明显降低（0.48±0.08比0.63±0.11、0.61±0.09，均P＜0.05），JNK1/2阳性细胞数（个/mm2）明显增多（34.13±4.57比16.15±1.09、16.23±2.05，均P＜0.05）；与模型组比较，补阳还五汤组脑组织中AKT1 mRNA表达（0.93±0.11）和JNK1/2阳性细胞数（45.04±5.68）明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论补阳还五汤可上调缺血脑组织AKT1 mRNA和JNK1/2阳性细胞数表达，是其脑保护作用机制之一。

基于质粒的蛋白激酶B1特异性小干扰RNA和P53共表达协同抑制肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨蛋白激酶B1(Akt1)特异性小干扰RNA(siRNA)和p53共表达质粒对肝细胞癌(HCC)细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。方法构建了一种共表达蛋白激酶B1(Akt1)特异性siRNA和野生型p53基因的双表达质粒(pSi-Akt1-P53)。将pSi-Akt1-P53共表达质粒转染至肝癌HepG2细胞,采用Real-time PCR法和免疫印迹法检测细胞中Akt1和P53表达被调控情况。然后将这种共表达质粒转染至HepG2细胞中,并同sh Akt1质粒和P53质粒相比较,分别采用CCK-8和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)实验、划痕实验、Transwell小室法、流式细胞术检测其对HepG2细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。结果pSi-Akt1-P53共表达质粒转染至肝癌HepG2细胞后显著地减少HepG2细胞中Akt1蛋白的表达,同时显著增加P53蛋白的表达。与sh Akt1质粒和P53质粒相比,pSiAkt1-P53共表达质粒更显著地抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,同时更显著地促进HepG2细胞的凋亡。结论pSi-Akt1-P53共表达质粒能非常显著地抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,有效促进肝癌HepG2细胞凋亡。

针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB/激活蛋白-1信号通路的影响

目的探讨针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信号通路的影响。方法将36只SD大鼠随机分为针刺组、模型组和对照组,各12只。采用胶原酶加肝素联合注射大鼠尾状核制备脑心综合征大鼠模型,对照组给予等剂量生理盐水向大鼠尾状核注入,手术操作过程同模型组。模型组和假手术组均不予针刺;针刺组选心俞穴、内关穴、风府穴和水沟穴,每日针刺1次,连续3天。采用原位末端凋亡(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)法测定脑组织细胞凋亡情况;神经功能采用Zea-Longa法评估;运用酶联免疫法测定白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平;采用Western Blot法测定MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达。结果模型组和针刺组大鼠脑组织细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠脑组织AI低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠神经行为评分高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠神经行为评分低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值低于模型组(P<0.05)。结论脑心综合征大鼠采用针刺可减轻大鼠脑组织细胞凋亡,减轻大鼠炎症因子,且可下调MAPK/NF-κB/AP-1信号通路表达。

蛋白激酶B1去类泛素化修饰抑制肝癌的增殖和转移

目的 探讨沉默泛素载体蛋白9（Ubc9）基因表达诱导蛋白激酶B1（AKT1）去类泛素化修饰,及其对肝癌细胞增殖和转移的影响.方法 利用RNA干扰技术沉默HepG2肝癌细胞Ubc9基因表达,Western blot法检测Ubc9、小泛素相关修饰蛋白1（SUMO1）和蛋白激酶B1（AKT1）蛋白表达水平,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测HepG2细胞增殖活性,细胞划痕实验和Transwell方法检测细胞迁移能力.建立荷瘤鼠模型,测量肿瘤体积并绘制生长曲线,解剖肿瘤组织并称重比较.采用原位细胞凋亡实验检测肿瘤组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测肿瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和 MMP-9的表达情况.结果 siR-Ubc9基因转染可使HepG2细胞中Ubc9、共轭SUMO1、游离SUMO1和AKT1蛋白水平均明显下降（均P〈0.05）.对照组、siR-neg组和siR-Ubc9组的细胞增殖指数分别为53.19%、54.25%和39.17%,细胞迁移距离分别为（59.47±4.66）μm、（56.56±5.37）μm和（34.57±6.61）μm,发生迁移的细胞数量分别为（89.44±8.36）个/视野、（93.84±8.79）个/视野和（41.67±5.39）个/视野,siR-Ubc9组与对照组和siR-neg组差异均有统计学意义（均P〈0.05）.对照组、siR-neg组和siR-Ubc9组的皮下肿瘤重量分别为（3.78±0.69）g、（3.72± 0.72）g和（2.09±0.61）g,细胞凋亡率分别为（7.79±2.21）%、（6.45±2.48）%,和（33.59±5.44）%,siR-Ubc9组与对照组和siR-neg组差异均有统计学意义（均P〈0.05）.对照组和siR-neg组肿瘤组织中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白均高表达,而siR-Ubc9组肿瘤组织中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达均低表达,差异均有统计学意义（均P〈0.05）.结论 通过沉默肝癌细胞中Ubc9基因表达能够诱导AKT1去SUMO化修饰,进而抑制肝癌细胞的增殖和转移,为未来肝癌基因治疗提供了新的借鉴方法.

八聚体结合转录因子4与蛋白激酶B1基因在卵巢浆液性肿瘤组织表达及耐药相关性研究

目的研究八聚体结合转录因子4(OCT4)和蛋白激酶B1(AKT1)基因在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达,探讨两者之间相关性及在化疗耐药中发挥的作用。方法全部病例来自中国医科大学附属盛京医院2004年1月至2010年10月。采用免疫组织化学SP法对67例卵巢浆液性腺癌(化疗耐药30例,化疗敏感37例)、10例卵巢交界性浆液性囊腺瘤、10例卵巢良性浆液性囊腺瘤和10例正常卵巢组织中OCT4和AKT1的表达情况进行检测。结果OCT4的阳性表达率在卵巢浆液性腺癌、卵巢交界性浆液性囊腺瘤、卵巢良性浆液性囊腺瘤和正常卵巢组织中依次降低,差异具有统计学意义(P=0.002);在耐药组和敏感组的阳性表达率分别为83.33%和45.95%,差异有统计学意义(P=0.002)。AKT1蛋白在正常组、良性组、交界性组和恶性组的阳性表达率分别为0、40.00%、70.00%、62.69%,差异具有统计学意义(P=0.001);在耐药组和敏感组的阳性表达率分别为76.67%和51.35%,两组比较,差异有统计学意义(P=0.033)。OCT4蛋白与卵巢浆液性癌临床病理因素无关,AKT1蛋白与卵巢浆液性癌的临床分期呈正相关(P<0.05)。OCT4与AKT1蛋白在耐药组中呈正相关(r=0.388,P=0.034);在敏感组无明显相关性(r=0.246,P=0.142)。结论 OCT4和AKT1可能与卵巢浆液性癌发生、发展相关,并可作为耐药性的预测指标;AKT1蛋白表达为卵巢浆液性癌的临床分期提供依据。

蛋白激酶B1基因多态性与重性抑郁障碍事件相关电位的关联性研究

目的 探讨重性抑郁障碍患者脑源性神经营养因子（BDNF）磷酸肌醇3-激酶（PI3-K）途径中蛋白激酶B1（PKB1）基因多态性与事件相关电位P300、CNV检测指标的关联性.方法 采用病例对照研究,选取重性抑郁障碍患者91例和与之性别、年龄相匹配的正常对照组65例.2组均于入组当日检测其P300及CNV数据.应用聚合酶链反应（PCR）和DNA直接测序技术,检测样本的PKB1基因多态性.分析重性抑郁障碍及正常对照组间P300、CNV均数差异.比较PKB1 SNP基因型间P300及CNV指标均数的差异.结果 ①与对照组比较,重性抑郁障碍患者的P300为P2潜伏期延长（P＜0.05）;P3a、P3b及P3波幅均明显减低（P＜0.01）;CNV则为B波幅明显减低（P＜0.01）、RT反应时间明显延长（P＜0.01）.②重性抑郁障碍患者P300指标在PKB1基因rs3001371含C等位基因的C/C及C/T合并组与TT组间有统计学差别.C/C及C/T合并组P3a、P3b及P3波幅[分别为（5.93±2.35）μV,（6.51±3.00）μV,（6.27±2.43）μV],低于TT基因型组[（分别为（7.45±2.19）μV,（8.63±3.57）μV,（8.04±2.57）μV],均差异有显著性（P＜0.05）.未发现rs3001371基因型间CNV的指标均数差异有显著性（P＞0.05）.结论 重性抑郁障碍患者PKB1基因rs3001371多态性与P300主成分波幅相关联,提示遗传因素对重性抑郁障碍记忆及认知功能可能有一定的影响.

靶向性蛋白激酶B1和环氧合酶-2shRNA腺病毒载体的构建和在人胃癌细胞的表达

目的构建靶向性蛋白激酶B1（PKB1／Akt1）和环氧合酶-2（COX-2）的短发夹RNA（shRNA）腺病毒载体，观察其在人胃癌细胞株SGC-7901中的表达。方法利用同源重组技术构建重组腺病毒载体pGSadeno—Akt1＋COX-2（pGSadeno—A＋C），经酶切及测序鉴定后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组rAd5-A＋C腺病毒，并测定病毒的滴度。体外转染人胃癌细胞株SGC-7901后，Real—timePCR和蛋白印迹分别检测Akt1和COX-2mRNA和蛋白质的表达。结果成功构建rAd5．A＋C重组腺病毒，测定包装的病毒滴度为1．0×10^10pfu／ml。转染组Akt1和COX-2mRNA表达明显下调，其ACt值分别是（12．26±0．05）和（5．41±0．09），比rAd5-HK空载组（10．63±0．02）、（3．75±0．08）和对照组（10．57-1-0．02）、（3．73±0．08）增高（P〈0．01），而空载组和对照组比较ACt值无明显变化（P〉0．05）。同样转染组Akt1和COX-2蛋白表达量与空载组和对照组比较分别下调70．5％和63．7％（P〈0．01），空载组和对照组比较Akt1和COX-2蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论靶向性Akt1和COX-2的shRNA腺病毒载体可以特异性抑制Akt1和COX-2的表达，可能成为胃癌靶向性Akt1和COX-2基因治疗的新策略。

蛋白激酶B1基因介导内质网类似激酶/真核细胞翻译启始子2α信号通路参与肺癌细胞增殖及细胞凋亡进程的机制

目的探讨蛋白激酶B1(Akt1)基因介导内质网类似激酶(PERK)/真核细胞翻译启始子2α(eIF2α)信号通路参与肺癌细胞增殖及细胞凋亡的机制。方法选择人肺腺癌细胞系A549按实验转染方案随机分组,分为空白(Blank)组、沉默Akt1(si-Akt1)阴性对照(NC)组、si-Akt1组、过表达Akt1(OE-Akt1)NC组、OE-Akt1组、CCT020312(PERK选择性激动剂)组和OE-Akt1+CCT020312组。应用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞中相关基因的mRNA和蛋白表达水平;同时分别应用噻唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡水平。两组间比较为t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果Si-Akt1组的Akt1的mRNA(0.99±0.05比0.45±0.03,t=16.04,P<0.05)和蛋白表达(0.32±0.03比0.12±0.01,t=10.95,P<0.05)低于si-Akt1 NC组。si-Akt1组PERK/p-PERK、eIF2α/p-eIF2α、GRP78和CHOP的mRNA(PERK:0.97±0.04比1.77±0.07,t=17.190,P<0.05;eIF2α:1.01±0.06比1.53±0.06,t=10.610,P<0.05;GRP78:1.06±0.03比1.98±0.08,t=18.650,P<0.05;CHOP:0.94±0.04比1.63±0.06,t=16.570,P<0.05)和蛋白表达(p-PERK:1.15±0.05比2.23±0.11,t=15.480,P<0.05;p-eIF2α:1.69±0.07比3.12±0.19,t=12.230,P<0.05;GRP78:0.84±0.05比2.87±0.15,t=22.650,P<0.05;CHOP:1.46±0.07比2.65±0.13,t=14.400,P<0.05)明显高于si-Akt1 NC组;细胞增殖能力明显低于si-Akt1 NC组(48 h:0.48±0.03比0.31±0.02,t=8.167,P<0.05;72 h:0.78±0.04比0.60±0.03,t=6.235,P<0.05),细胞凋亡率明显高于si-Akt1 NC组(8.58±1.34比23.4±2.4,t=9.250,P<0.05)。同时,CCT020312组PERK/p-PERK、eIF2α/p-eIF2α、GRP78和CHOP的mRNA(PERK:1.00±0.04比1.87±0.08,t=26.940,P<0.05;eIF2α:1.00±0.05比1.57±0.07,t=11.640,P<0.05;GRP78:1.00±0.03比2.02±0.10,t=41.640,P<0.05;CHOP:1.00±0.06比1.66±0.07,t=20.210,P<0.05)和蛋白表达(p-PERK:1.12±0.05比2.30±0.11,t=16.910,P<0.05;p-eIF2α:1.65±0.05比3.20±0.18,t=13.260,P<0.05;GRP78:0.80±0.04比2.74±0.15,t=21.640,P<0.05;CHOP:1.44±0.06比2.61±0.13,t=14.150,P<0.05)明显高于Blank组;细胞增殖能力明显低于Blank组(48 h:0.46±0.03比0.29±0.02,t=8.167,P<0.05;72 h:0.80±0.04比0.57±0.03,t=7.967,P<0.05),细胞凋亡率明显高于Blank组和相应NC组(8.71±1.44比23.43±2.36,t=9.222,P<0.05)。然而,OE-Akt1组的Akt1的mRNA(0.99±0.05比1.88±0.09,t=14.970,P<0.05)和蛋白表达(0.31±0.03比0.87±0.04,t=19.400,P<0.05)明显高于OE-Akt1 NC组,PERK/p-PERK、eIF2α/p-eIF2α、GRP78和CHOP的mRNA(PERK:0.98±0.05比0.65±0.05,t=8.656,P<0.05;eIF2α:1.03±0.05比0.47±0.04,t=12.970,P<0.05;GRP78:1.2±0.04比0.32±0.03,t=30.210,P<0.05;CHOP:0.99±0.03比0.55±0.04,t=11.940,P<0.05)和蛋白表达(p-PERK:1.16±0.05比0.99±0.05,t=4.164,P<0.05;p-eIF2α:1.69±0.07比1.23±0.07,t=8.642,P<0.05;GRP78:0.86±0.04比0.34±0.02,t=20.140,P<0.05;CHOP:1.48±0.06比0.71±0.04,t=19.880,P<0.05)明显低于OE-Akt1 NC组,细胞增殖能力(48 h:0.45±0.03比0.60±0.02,t=7.206,P<0.05;72 h:0.76±0.04比0.97±0.05,t=5.681,P<0.05)明显高于OE-Akt1 NC组,细胞凋亡率(8.62±1.32比4.36±0.75,t=4.860,P<0.05)明显低于OE-Akt1 NC组(均值P<0.05)。结论沉默Akt1表达可通过促进PERK/eIF2α信号通路的激活,进而抑制肺癌细胞增殖,促进其凋亡。

肝缺血再灌注时葡萄糖调节蛋白78、葡萄糖调节蛋白94、磷酸化蛋白激酶B1及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-12的表达及意义

目的动态观察大鼠肝缺血再灌注（HIRI）不同时限葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、葡萄糖调节蛋白94（GRP94）、磷酸化蛋白激酶B1（p-Akt1）及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶12（Caspase-12）的表达变化，并探讨其意义。方法将55只Wistar雄性大鼠随机分为正常组（n=5）、假手术组（n=25）、缺血再灌注组（n=25），无损伤动脉钳阻断肝血流45min后使其复流，用免疫组织化学法检测GRP78、GRP94及Caspase-12在再灌注0、3、12、24、72h时的蛋白表达，用Western blot法检测同期p-Akt1蛋白表达。结果GRP78在缺血再灌注组的表达显著高于正常组与假手术组（P〈0．01），在缺血再灌注0h时表达开始上升（393．04±79．06），12h时达峰值（2369．38±182．53），24h（1023．02±185．61）及72h（505．19±102．89）表达开始下降，但仍高于前述各组表达水平。GRP94在缺血再灌注组的表达显著高于正常组与假手术组（P〈0．01），在缺血再灌注0h时表达开始上升（168．47±21．08），12h时达峰值（678．80±52．62），24h（425．78±38．63）及72h（173．99±36．82）表达降低。Caspase-12在缺血再灌注组的表达显著高于正常组与假手术组（P〈0．01），在缺血再灌注0h时表达开始上升（647．00±73．68），12h达峰值（6867．67±601．11），24h（2356．12±210．65）及72h（675．89±109．3）表达开始降低。p-Akt1在缺血再灌注组各观察时限点的表达趋势与GRP78一致，显著高于正常组及假手术组。结论大鼠肝缺血再灌注损伤可触发经内质网途经的Caspase级联反应活化；GRP78与GRP94可能通过降低内质网负荷和促进糖异生而发挥细胞保护作用；p-Akt1可能是此过程中机体通过磷酸肌醇3激酶（P13K）／Akt信号通路上调GRP78表达的重要信号分子。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/FoxO1信号通路和白细胞介素17在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中的表达变化

目的探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/FoxO1和白细胞介素17(IL-17)与自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病的相关机制。方法将C57BL/6小鼠60只随机分为对照组和模型组(EAE),每组30只。采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35~55)联合完全弗氏佐剂诱导建立EAE模型。观察各组小鼠的行为学评分,并于评分4分时取各组小鼠的脊髓、脾脏和外周血。HE染色及Luxol fast blue染色观察脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失情况;脾细胞在体外用a-CD3和MOG35~55分别刺激7 d,收集其上清液,ELISA检测小鼠脾细胞上清液和血清中细胞因子白细胞介素17(IL-17)和干扰素γ(IFN-γ)的含量;流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+IL-17+细胞的百分比;Western blotting检测IL-17及PI3K/Akt/FoxO1在小鼠脊髓中表达。结果与对照组相比,EAE组小鼠行为学评分明显高于对照组(P<0.05);HE染色及Luxol fast blue染色结果显示,EAE组脊髓病理组织表现出炎性浸润和髓鞘脱失显著增多(P<0.05)。ELISA结果显示,EAE组血清中及体外培养脾细胞的上清中IL-17和IFN-γ的含量明显升高。流式结果表明,EAE组小鼠脾细胞中CD4+IL-17+T细胞的百分比明显增加(P<0.05)。Western blotting结果显示,EAE组小鼠脊髓IL-17、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平明显升高,但磷酸化FoxO1(p-FoxO1)蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论 EAE组小鼠脊髓中促炎因子IL-17分泌增加,可能与PI3K/Akt/FoxO1信号通路活化进而激活T细胞功能有关。

肝豆汤通过肝激酶B1/AMP活化蛋白激酶途径改善高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性

目的研究肝豆汤对高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性的影响及可能的机制。方法采用60只C57BL/6雄性小鼠,按随机数字表法分为六组:正常饮食组,模型组,东宝肝泰组,肝豆汤低、中、高剂量组,每组10只。除正常饮食组外,其余各组均给予高脂饲料造模,同时分别灌胃给予生理盐水,东宝肝泰冲剂0.225 g/kg,肝豆汤(22,44,66 g/kg)各2 mL·kg^(-1)·d^(-1),药物干预6周后,禁食24 h,采用苏木精-伊红(HE)和油红O染色观察各组小鼠肝组织病理变化及肝脏脂滴数量,采用试剂盒测定各组小鼠肝组织总胆固醇、三酰甘油的含量及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性,采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测小鼠肝脏3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、尼曼匹克C1型类似蛋白(NPC1L1)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)及磷酸化肝激酶B1(p-LKB1)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC)、磷酸化AMP活化蛋白激酶(p-AMPK)相对表达情况。结果与正常组[(12.78±1.17)IU/L、(6.08±0.71)IU/L、(1.90±0.10)mmol/L、(1.83±0.09)mmol/L]相比,模型组小鼠肝组织出现脂肪变性,肝细胞肿大,脂肪滴增多等病变,小鼠血清中AST(18.81±1.14)IU/L、ALT活性(9.65±0.90)IU/L、肝组织中总胆固醇(2.48±0.08)mmol/L、三酰甘油含量(3.12±0.10)mmol/L及HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白相对表达量均升高,p-AMPK、p-LKB1、p-ACC蛋白相对表达量均降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,肝豆汤低、中、高剂量组小鼠肝组织病变依次减轻,血清AST[(16.30±1.18)IU/L、(14.020±1.15)IU/L、(12.20±1.12)IU/L]、ALT活性[(8.58±0.86)IU/L、(7.18±0.83)IU/L、(6.18±0.65)IU/L]、肝组织中总胆固醇[(2.36±0.11)mmol/L、(2.03±0.09)mmol/L、(1.91±0.10)mmol/L]、三酰甘油含量[(2.52±0.08)mmol/L、(1.96±0.09)mmol/L、(1.84±0.10)mmol/L]及HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白相对表达量依次降低,p-ACC、p-AMPK、p-LKB1蛋白相对表达量依次升高(P<0.05),东宝肝泰组小鼠血清中AST(14.52±1.16)IU/L、ALT活性(7.16±0.90)IU/L、肝组织中总胆固醇(2.01±0.09)mmol/L、三酰甘油含量(1.95±0.09)mmol/L及HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白相对表达量均降低,p-ACC、p-AMPK、p-LKB1蛋白相对表达量均升高(P<0.05),其中肝豆汤中剂量组与东宝肝泰组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝豆汤可改善高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性,其机制可能与激活LKB1/AMPK信号通路有关。

柠檬酸盐对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤及LKB1/AMPK信号通路的影响

目的:探讨柠檬酸盐对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤及肝激酶B1(LKB1)/磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响。方法:将人心肌细胞(HCM)随机分为对照组(常规培养的HCM细胞)、H/R组(缺氧处理2.5 h,复氧处理2 h)、柠檬酸盐低、中、高剂量组(20μmol/mL、40μmol/mL、80μmol/mL柠檬酸盐培养液)、柠檬酸盐高剂量+抑制剂组(3 mg/kg LKB1/AMPK通路抑制剂Doxorubicin HCI、80μmol/mL柠檬酸盐培养液)。采用细胞增殖毒性检测(CCK-8)法测定各组HCM细胞增殖抑制率,生化法测定各组HCM细胞培养液中心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,流式细胞仪检测各组HCM细胞凋亡率,蛋白免疫印迹(Western Bloting)法测定HCM中凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)及LKB1/AMPK通路相关蛋白的表达水平。结果:与对照组相比,H/R组HCM的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、CK-MB、LDH及Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与H/R组相比,柠檬酸盐低、中、高剂量组HCM的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、CK-MB、LDH及Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与柠檬酸盐高剂量组相比,柠檬酸盐高剂量+抑制剂组HCM的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、CK-MB、LDH及Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:柠檬酸盐可以促进受损的HCM细胞生存,可能与激活LKB1/AMPK信号通路有关。

LKB1/AMPK通路在糖尿病肥胖大鼠心肌损伤中的作用

目的 探讨肝激酶(LK)B1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路在糖尿病(DM)肥胖大鼠心肌损伤中的作用。方法 SD雄性大鼠60只,随机选取15只为空白组,其余大鼠采用高脂高糖膳食辅以链脲佐菌素(STZ)腹腔注射构建DM肥胖大鼠模型。筛选模型成功大鼠30只分为模型组和AMPK激活剂组,每组15只。AMPK激活剂组腹腔注射5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)100 mg/kg,空白组和模型组腹腔注射等体积生理盐水,1次/d,连续5 d。5 d后取材进行相关指标的检测。记录大鼠体重和体长变化,计算Lee指数;超高分辨率小动物超声影像系统测量大鼠左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、射血分数(EF),短轴缩短率(FS);血糖仪检测空腹血糖(FPG),生化法检测血清胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HbA1c)水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);生化法检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活性,肌酸激酶同工酶(CK)MB、肌酸激酶(CK)水平;心肌苏木素-伊红(HE)染色、Masson染色,高倍光镜下观察心脏组织形态变化;Western印迹测定心肌组织中LKB1、AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)及p-ACC蛋白表达。结果 与空白组相比,模型组心肌细胞形态不规则、排列紊乱、局部肌纤维横纹消失,可见心肌细胞水肿,纤维增生明显,心肌细胞变性、坏死;体重、Lee指数、FPG、FINS、HbA1c、HOMA-IR、LVESD、LVEDD、CKMB、CK、TC、TG、MDA水平、心肌组织ACC蛋白显著升高,EF、FS、SOD、心肌组织p-LKB1/LKB1、p-AMPKα/AMPKα、p-ACC显著降低(均P<0.05)。与模型组相比,AMPK激活剂组心肌细胞水肿减轻,心肌纤维排列较为整齐,心肌纤维增生情况明显好转;FPG、FINS、HbA1c、HOMA-IR、血清CKMB、CK、TG、TC、MDA水平、LVESD、LVEDD、心肌组织ACC蛋白明显下降,EF、FS、血清SOD水平、心肌组织p-LKB1/LKB1、p-AMPKα/AMPKα、p-ACC蛋白明显升高(均P<0.05)。结论 DM肥胖症可出现心肌结构和功能损伤,这可能与糖脂代谢紊乱、氧化应激及LKB1/AMPK信号通路被抑制有关。

CKS1B在肺腺癌中的表达、临床和生物学意义分析

目的 探讨CDC28蛋白激酶调节亚基1B(CKS1B)在肺腺癌中的表达特点,以及临床和生物学意义。方法 采用Wilcoxon检验分析CKS1B在8个肺腺癌数据集中的表达特点;采用Kaplan-Meier曲线、Log-rank检验、多因素Cox回归分析CKS1B和肺腺癌预后的关系;采用Wilcoxon检验分析CKS1B和肺腺癌临床分期、TNM分期的关系;采用基因集富集分析CKS1B在肺腺癌组织中的生物富集特点;采用肿瘤单细胞、癌症细胞系百科全书数据库分析肺腺癌细胞中CKS1B的生物学意义;采用Maftools包分析CKS1B和肺腺癌驱动基因突变特点的关系。结果 CKS1B在肺腺癌组织中呈高表达,CKS1B高表达预示着较差的肺腺癌总生存期和无进展生存期,且是生存预后的独立危险因素(P<0.05);CKS1B和较高的临床分期、TNM分期有关(P<0.05);肺腺癌组织中、肺腺癌细胞中CKS1B皆显示与细胞恶性增殖呈正相关(P<0.05);CKS1B高表达的肺腺癌驱动基因突变更为紊乱剧烈。结论 CKS1B在肺腺癌中高表达,且预示着较差的临床分期和恶性生物学行为,有望成为肺腺癌防治的新靶点。

miR-16-1抑制淋巴瘤细胞侵袭及对AKT1基因水平的作用机制

目的探讨miR-16-1对淋巴瘤细胞凋亡、侵袭及苏氨酸蛋白激酶B(ProteinkinaseB,Akt)1基因作用机制的研究。方法收集我院淋巴瘤患者肿瘤标准及正常胸腺标本,购自上海通派公司的人T淋巴瘤细胞Raji亚系,分为淋巴瘤组(未经转染)、NC组(Raji细胞转染miR-16-1-NC)、miR-16-1组(Raji细胞转染miR-16-1minmics)及药物对照组(Raji细胞联合1mmol/L+10μmol/L的地西他滨),分别采用qRT-PCR方法检测肿瘤及正常组织、Raji细胞的miR-16-1相对表达,分别采用MTT方法、流式细胞仪、Transwell小室方法检测Raji细胞存活率、凋亡率、侵袭数目及迁移率;分别采用双荧光素酶报告基因、qRTPCR及免疫印迹检测AKT1、张力蛋白同源基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)及其磷酸化表达。结果与正常组织表相比,miR-16-1在淋巴瘤病理组织中表达下调,组间比较存在差异(P<0.001);NC组和淋巴瘤组Raji细胞中miR-16-1表达无统计学意义(P>0.05),与NC组相比,miR-16-1组miR-16-1升高,存在差异(P<0.05);NC组和淋巴瘤组细胞存活率无意义(P>0.05),与NC组miR-16-1组细胞存活率降低存在差异(P<0.05);NC组和淋巴瘤组Raji细胞凋亡率无差异(P>0.05),miR-16-1组凋亡率高于NC组,组间无差异(P>0.05);NC组和淋巴瘤组Raji细胞侵袭数目无差异(P>0.05),miR-16-1组侵袭数目低于NC组,存在差异(P<0.05);NC组和淋巴瘤组Raji细胞迁移率比较无差异(P>0.05),miR-16-1组细胞迁移率低于NC组(P<0.05);miR-16-1组细胞中AKT1、PTEN基因及其磷酸化蛋白与NC组、淋巴瘤组比较均存在差异(P<0.05);双荧光素酶报告:与miR-NC相比,miR-16-1mimics可降低野生型AKT1活性,增加野生型PTEN的活性,说明AKT1、PTEN可能是miR-16-1的靶基因。结论人T淋巴瘤细胞Raji转染miR-16-1 mimics后,能够抑制其细胞活性,减少侵袭及迁移,加快凋亡,研究机制可能与调控AKT1、PTEN信号通路活性相关。

CKS1B参与拟穴青蟹性腺发育的研究

CDC28蛋白激酶调节亚基1B(CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B,CKS1B)是高度保守的CKS1家族成员之一,在细胞周期中作为细胞周期蛋白激酶的调节亚基参与调控真核生物的细胞分裂。因此,研究CKS1家族基因参与甲壳动物性腺发育调节的分子机制具有重要的意义。从已构建的拟穴青蟹性腺EST数据库中筛选到CKS1B基因片段,继而克隆出其全长c DNA序列(Sp-CKS1B),并利用q RT-PCR技术检测其在不同组织和性腺不同发育阶段中的差异表达。结果显示,获得Sp-CKS1B的全长c DNA序列722 bp,其中5'UTR为82 bp,3'UTR为379 bp,开放阅读框261 bp,编码86个氨基酸,包含一段典型的CKS保守序列,属于CKS家族蛋白。在不同组织q RT-PCR结果显示,Sp-CKS1B基因在O5期雌蟹卵巢中的表达水平最高,并与其他组织具有极显著差异(P<0.01);同时,在性腺不同发育阶段的表达结果显示,Sp-CKS1B基因在精巢T1期的表达量最高,其次为O5期,二者显著高于卵巢O1-O4期的表达水平(P<0.05);而在精巢T3期的表达量最低,并显著低于T1、T2以及卵巢O4、O5期的表达水平(P<0.05)。结果说明了Sp-CKS1B在拟穴青蟹的性腺发育过程中可能具有十分重要的作用。

miR-485-5p靶向CKS1B对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响

目的探讨微小RNA(miR)-485-5p对鼻咽癌CNE2细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移和上皮间质转化的影响及其机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-485-5p在人永生化鼻咽上皮细胞系NP69和人鼻咽癌细胞系CNE2中的表达情况;将体外培养的CNE2细胞分为Con组(正常培养)、NC组(转染mimics阴性对照)和mimics组(转染miR-485-5p mimics),实时荧光定量PCR测定miR-485-5p表达,噻唑蓝法、Transwell小室、流式细胞术分别检测细胞增殖活性、侵袭和迁移、凋亡,免疫印迹法检测细胞中E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和CDC28蛋白激酶调节亚基(CKS)1B蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-485-5p和CKS1B靶向关系。结果与NP69细胞比较,miR-485-5p在CNE2细胞中的表达水平明显降低(P<0.05)。与Con组、NC组比较,mimics组细胞中miR-485-5p表达水平、细胞凋亡率和E-钙黏蛋白表达水平均明显升高,而增殖活力、侵袭与迁移能力和N-钙黏蛋白、波形蛋白、CKS1B蛋白表达均显著降低(P<0.05)。miR-485-5p可与CKS1B靶向结合。结论miR-485-5p可能通过靶向调控CKS1B表达抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖、迁移、侵袭与上皮间质转化,并促进CNE2细胞凋亡。

藏花酸通过激活LKB1/AMPK通路改善妊娠糖尿病大鼠的胰岛素敏感性

目的:探索藏花酸(CRO)通过激活肝激酶B1(LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路对改善妊娠糖尿病(GDM)大鼠的胰岛素敏感性的作用。方法:选取雌、雄SD大鼠在发情期进行交配,孕鼠通过尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)建立GDM大鼠模型。造模后,将大鼠随机分为正常对照组、模型组、CRO低(CRO-L,20 mg·kg^(-1))、中(CRO-M,40 mg·kg^(-1))、高(CRO-H,60 mg·kg^(-1))剂量组、Radicicol组(LKBI抑制剂,40 mg·kg^(-1))、CRO-H+Radicicol组(60 mg·kg^(-1)CRO+40 mg·kg^(-1)Radicicol),每组10只。药物组、抑制剂组分别以尾部注射相应剂量的药物、抑制剂干预,其余各组给予生理盐水。干预结束后,分别检测大鼠空腹血糖(FPG)、胰岛素(FINS)水平、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)以评价胰岛素抵抗情况;检测总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)含量以及血清中炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平以评价血脂及全身炎症变化;最后分离大鼠胰岛组织,观察其病理改变并检测AMPK通路相关蛋白LKB1、p-LKB1、组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)、p-HDAC4、AMPK、p-AMPK的蛋白表达及炎症因子IL-6、TNF-α水平变化。结果:模型组和Radicicol组大鼠胰岛组织炎性浸润及病理损伤严重,IL-6、TNF-α、病理评分、FPG、FINS、HOMA-IR、TC、LDL-C、TG、p-HDAC4/HDAC4较正常对照组均显著增加(P<0.05),p-AMPK/AMPK、p-LKB1/LKB1显著降低(P<0.05);经CRO干预后,大鼠IL-6、TNF-α、病理评分、FPG、FINS、HOMA-IR、TC、LDL-C、TG、p-HDAC4/HDAC4较模型组均显著降低(P<0.05),p-AMPK/AMPK、p-LKB1/LKB1显著增加(P<0.05)。给与Radicicol可逆转CRO对GDM大鼠的保护作用(P<0.05)。结论:CRO可增强GDM大鼠胰岛素敏感性,改善大鼠胰岛组织病理损伤以及全身炎症水平,该作用可能依赖于激活LKB1/AMPK信号通路。

苦参碱对食管癌Eca-109细胞自噬的影响及作用机制

目的 探讨苦参碱对食管癌Eca-109细胞自噬的影响及其可能的作用机制。方法 将传代培养的Eca-109细胞分为对照组、低浓度苦参碱组、中浓度苦参碱组和高浓度苦参碱组。对照组细胞加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,低、中、高浓度苦参碱组细胞分别加入终质量浓度为1.0、1.5、2.0 g·L^(-1)的苦参碱溶液;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞的活性,免疫荧光细胞化学染色法检测各组细胞中自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)的定位及表达,Western blot法检测各组细胞中多聚蛋白62(P62)、LC3蛋白的相对表达量,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量,透射电子显微镜观察对照组和高浓度苦参碱组Eca-109细胞的超微结构。另取传代培养的Eca-109细胞,将细胞分为对照组、自噬抑制剂组、苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组。对照组细胞加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,自噬抑制剂组细胞加入终浓度为7μmol·L^(-1)的3-甲基腺嘌呤(3-MA)溶液,苦参碱组细胞加入终质量浓度为2.0 g·L^(-1)的苦参碱溶液,自噬抑制剂+苦参碱组细胞先加入终浓度为7μmol·L^(-1) 3-MA溶液预孵育3 h,再加入终质量浓度为2.0 g·L^(-1)苦参碱溶液;培养24 h后,采用Western blot法检测各组细胞中Beclin1、LC3和肝激酶B1(LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白的表达。结果 低、中、高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于对照组(P<0.05);中、高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。对照组、低浓度苦参碱组、中浓度苦参碱组和高浓度苦参碱组Eca-109细胞质中均可见到红色荧光标记的LC3蛋白阳性表达。对照组细胞中LC3蛋白呈弥散状态;各浓度苦参碱组细胞中LC3蛋白呈斑点状态,且苦参碱浓度越高,细胞质中呈斑点状LC3蛋白越多。低、中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量显著低于对照组(P<0.05);中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量显著低于低浓度苦参碱组(P<0.05);中浓度苦参碱组与高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。低浓度苦参碱组与对照组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05);中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于对照组和低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。低、中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。对照组细胞中可见正常的细胞质、细胞器和细胞核,高浓度苦参碱组细胞质中可见大量大小不等的自噬泡,并可见包裹有细胞内容物的自噬体。自噬抑制剂组与对照组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05);苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均显著高于对照组和自噬抑制剂组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均显著低于苦参碱组(P<0.05)。自噬抑制剂组Eca-109细胞中磷酸化LKB1(p-LKB1)/LKB1、磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK显著低于对照组,磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR显著高于对照组(P<0.05);苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于对照组,p-mTOR/mTOR显著低于对照组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于对照组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组与对照组Eca-109细胞中p-mTOR/mTOR比较差异无统计学意义(P>0.05)。苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于自噬抑制剂组,p-mTOR/mTOR显著低于自噬抑制剂组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著低于苦参碱组,p-mTOR/mTOR显著高于苦参碱组(P<0.05)。结论 苦参碱可能通过调节LKB1/AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达诱导食管癌Eca-109细胞发生自噬。

丹栀逍遥散对非酒精性脂肪性肝病大鼠LKB1/AMPK/ACC通路及肝脂肪变性的影响

目的:探讨丹栀逍遥散对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝脏激酶B1(LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/乙酰辅酶A羧化酶(ACC)通路及肝脂肪变性的影响。方法:SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、水飞蓟宾组(26.25 mg·kg^(-1))、丹栀逍遥散高、中、低剂量组(38.0、19.0、9.5 g·kg^(-1)),每组13只。采用高脂饲料连续喂养8周复制非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠模型。模型复制成功后水飞蓟宾组和丹栀逍遥散各剂量组大鼠开始灌胃给予相应的药物,连续给药4周,给药结束后进行取材和相关指标的检测。给药期间,观察各组大鼠的精神状况、毛色、饮食、活动等一般状态,记录给药前后大鼠体重变化;取大鼠肝、肾、脾脏并称重,计算脏器指数;生化法检测肝组织中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(NEFA)含量;苏木精-伊红染色(HE)观察各组大鼠肝组织病理变化;Western blot检测肝组织中LKB1、AMPKα1、AMPKα2、ACC及其磷酸化水平。结果:与空白组相比,模型组大鼠毛色发黄暗淡,精神萎靡;体重增量、肝脏指数、肝组织中ALT、AST、TG、TC、NEFA水平均显著升高(P<0.05),肝细胞排列紊乱,胞界不清晰,较多的脂肪空泡;肝细胞中LKB1、p-LKB1、AMPKα1、p-AMPKα1、AMPKα2、p-AMPKα2、p-ACC蛋白表达水平明显降低,ACC蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,水飞蓟宾组和丹栀逍遥散高、中剂量组大鼠一般状态有不同程度的改善,体重增量、肝脏指数、肝组织中ALT、AST、TG、TC、NEFA水平均显著降低(P<0.05),病理损伤程度减轻;肝细胞中LKB1、p-LKB1、AMPKα1、p-AMPKα1、AMPKα2、p-AMPKα2、p-ACC蛋白表达水平明显升高,ACC蛋白表达降低(P<0.05)。结论:丹栀逍遥散可能通过LKB1/AMPK/ACC信号通路,降低脂肪的合成,改善肝功能,减轻NAFLD模型大鼠肝脂肪变性。