血管内皮生长因子调节蛋白激酶C表达对子宫内膜异位症间质细胞侵袭性的影响

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)调节蛋白激酶C(PKC)表达对子宫内膜异位症(EMs)间质细胞侵袭性的影响。方法收集因卵巢EMs行手术并经术后病理证实为EMs的20例患者在位及异位内膜组织,分为EMs在位内膜组及EMs异位内膜组,收集同期因其他卵巢良性肿瘤行手术的10例患者子宫内膜作为对照组,应用免疫组织化学染色法及Western blot法检测各组子宫内膜中VEGF及PKC蛋白表达情况;分离培养EMs在位内膜间质细胞与非EMs子宫内膜间质细胞,应用细胞免疫鉴定法鉴定间质细胞,应用免疫荧光染色法及Western blot法检测各组间质细胞中VEGF和PKC蛋白表达及定位情况;采用VEGF-siRNA转染EMs子宫内膜间质细胞,采用Western blot法检测沉默VEGF后EMs间质细胞的VEGF、PKC蛋白表达变化,采用Transwell法检测其侵袭性的变化。结果与对照组相比,EMs在位内膜组及EMs异位内膜组VEGF、PKC蛋白表达均升高,且EMs异位内膜组中的表达水平高于EMs在位内膜组(P均<0.01)。EMs子宫内膜间质细胞中VEGF蛋白、PKC蛋白荧光染色均能看到绿色荧光,VEGF蛋白在子宫内膜间质细胞质和细胞核中均有表达,而PKC蛋白主要表达在子宫内膜间质细胞质中。Western blot结果显示,与对照组相比,EMs组VEGF及PKC蛋白表达均升高(P均<0.001);培养72 h后siRNA转染效率最高;与si R-NC组比较,VEGF-siRNA转染后EMs间质细胞中VEGF、PKC蛋白表达水平均降低(P均<0.001);Transwell结果显示,与siR-NC组及空白对照组比较,VEGF-siRNA转染后,EMs间质细胞的侵袭细胞数减少(P均<0.001)。结论VEGF可能通过调节PKC蛋白表达,继而改变细胞侵袭活性,诱导EMs的发生和发展。

蛋白激酶C活性变化对Adipophilin介导THP-1巨噬细胞脂质蓄积的影响

以THP-1巨噬细胞为研究对象,观察蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波酯(PMA)和抑制剂钙磷酸结合蛋白C(CalphostinC)对胞膜PKC活性、胞膜PKCα及胞浆内过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)和adipophilin表达以及细胞内脂质蓄积的影响,初步探讨PKC调控adipophilin表达及脂质蓄积的作用机制.采用PepTagRAssay、RT-PCR、蛋白质印迹、油红O染色和高效液相色谱法,观察到100nmol/LPMA在激活胞膜PKC((0.2514±0.0154)U/ml)的同时可以与氧化低密度脂蛋白(oxLDL)协同增强PKCα、PPARγ和adipophilin表达并使细胞内脂滴的蓄积极大地增强.细胞内胆固醇酯/总胆固醇比值增至(69.8±9.5)%;300nmol/L CalphostinC对荷脂THP-1巨噬细胞的处理则抑制酶活性至((0.0927±0.0056)U/ml,细胞内脂滴减少,胆固醇酯/总胆固醇比值降至(40.1±9.1)%;CalphostinC呈剂量依赖性的方式下调酶活性、PKCα、PPARγ和adipophilin表达,400nmol/LCalphostinC基本上可以逆转50mg/LoxLDL诱导的酶活化和PKCα、PPARγ和adipophilin表达的上调.结果提示,蛋白激酶C活性的改变可以影响adipophilin介导的脂质蓄积,其中PPARγ可能在这一调控机制中发挥了重要作用.

adipophilin及蛋白激酶C在动脉粥样硬化模型中的表达

目的探讨动脉粥样硬化病变区动脉壁增厚与adipophilin表达及蛋白激酶C(PKC)活性三者之间的关系。方法将24只新西兰白兔随机分为对照组(12只)和实验组(12只)。高TC饮食喂饲12周,动脉切片HE染色;采用PepTagAssay法检测PKC活性变化,Western blot印迹和免疫组织化学染色检测PKCα和adipophilin表达。并进一步在细胞学水平观察平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞PKC活性的分布及adipophilin的表达。结果主动脉病变区可见内膜增生、中层增厚,脂质条纹突起,增生内膜内蓄积大量的泡沫细胞。病变区PKC活性和adi-pophilin表达上调,与adipophilin阳性颗粒仅局限于增生内膜不同,PKCα在内膜、近内膜的中层区均呈强阳性表达。细胞学实验显示adipophilin表达于巨噬细胞,而PKC活性则以平滑肌细胞最强,内皮细胞最弱。结论动脉粥样硬化病变区内膜增生、中层增厚可能与PKC介导的细胞增殖凋亡紊乱及adipophilin介导的脂质蓄积有关。在巨噬细胞adipophilin的表达可能与细胞膜PKC活性的改变有着某种潜在联系。

周期蛋白D1在蛋白激酶C调控哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的:观察蛋白激酶C(PKC)激活后哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)周期蛋白D1(cyclin D1)的表达变化及两者表达相关性,探讨cyclin D1在PKC调控哮喘大鼠ASMCs增殖中所起的作用。方法:卵清蛋白(OVA)吸入制备SD大鼠2周哮喘模型,原代培养ASMCs。采用正常大鼠(N组)和模型大鼠(A组)第3-6代细胞,分别应用PKC特异性激活剂12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)及抑制剂Ro-31-8220干预ASMCs,根据不同处理分为4组:(1)空白组;(2)10nmol/L PMA组;(3)10nmol/L PMA+5μmol/L Ro-31-8220组;(4)5μmol/L Ro-31-8220组。采用流式细胞术,四甲基偶氮唑盐(MTT)法,增殖细胞核抗原(PCNA)染色等方法观察药物对ASMCs增殖的影响。RT-PCR方法检测PKC-α和cyclin D1 mRNA表达水平,Western blotting方法检测PKC-α和cyclin D1蛋白表达水平。线性相关分析评价PKC-α和cyclin D1表达水平的关系。结果:(1)在哮喘组,与空白对照比较,PMA组、Ro-31-8220组S+G2/M期比例、吸光度A值、PCNA阳性表达率,差异显著(P<0.01)。在正常组,与空白对照相比,PMA组、Ro-31-8220组S+G2/M期比例、吸光度A值、PCNA阳性表达率差异均显著(P<0.01)。(2)哮喘组内PMA组、Ro-31-8220组PKC-α以及cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平与空白对照比较,差异显著(P<0.01)。正常组和哮喘组变化趋势一致。(3)在mRNA水平,大鼠ASMCs PKC-α和cyclin D1的表达呈明显正相关(r=0.476,P<0.05),在蛋白水平两者的表达亦呈明显正相关(r=0.899,P<0.01)。结论:PKC-α能促进正常大鼠和哮喘大鼠ASMCs增殖,其在基因和蛋白的表达水平与cyclin D1的表达呈正相关,提示PKC-α可能通过调节cyclin D1而影响ASMCs的增殖。

急性胰腺炎患者血浆D-二聚体含量及外周血淋巴细胞蛋白激酶C活性的变化及意义

目的通过对急性胰腺炎患者血浆D-二聚体含量及淋巴细胞蛋白激酶C(PKC)活性的检测,探讨其在急性胰腺炎病程演变中的作用,从而为急性胰腺炎的早期抗纤溶治疗及选择特异性的PKC拮抗剂提供理论依据。方法采用双抗体夹心Elisa法和同位素γ-32P-ATP催化活性测定法分别对实验组和对照组进行血浆D-二聚体含量及淋巴细胞PKC活性的检测。结果急性轻型胰腺炎组血浆D-二聚体水平及淋巴细胞PKC活性较对照组均有所增高(P<0.05),急性重症胰腺炎组血浆D-二聚体水平及淋巴细胞PKC活性较正常对照组明显增高(P<0.01)。而血浆D-二聚体及淋巴细胞PKC活性比较,重症胰腺炎组显著高于轻型组(P<0.01)。结论血浆D-二聚体含量及淋巴细胞PKC活性变化与急性胰腺炎的病程演变关系密切,血浆中D-二聚体含量可作为急性胰腺炎的辅助诊断、预后监测及疗效追踪的一项有用的检测指标。在急性胰腺炎早期行抗纤溶治疗及选择特异性的PKC拮抗剂具有重要意义。

人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体上。测序鉴定后切下相应的片段,连接到表达载体pET-22b(+)上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3),使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Westernblotting鉴定表达蛋白。【结果】用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌,Westernblot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体,后两者在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。

Amadori糖化白蛋白对牛视网膜血管二酯酰甘油——蛋白激酶C级联的影响

目的 :探讨Amadori糖化血清白蛋白对牛视网膜血管二酯酰甘油 (DAG)———蛋白激酶C(PKC)信号级联的影响及d-α-生育酚的干预作用。方法 :体外制备的Amadori糖化的牛血清白蛋白 (AGSA)分别在生理浓度葡萄糖 (5 .5mmol/L)和高浓度葡萄糖 (2 0mmol/L)培养液中作用于新鲜牛视网膜血管。采用薄层层析和放射自显影法测定DAG含量和PKC活性 ;并检测d -α-生育酚预处理后DAG、PKC改变。结果 :在生理葡萄糖浓度下 ,牛视网膜血管暴露于AGSA2 4h或 72h后细胞内DAG含量、PKC活性均较对照组显著增加 ,当AGSA和高葡萄糖同时作用于牛视网膜血管时 ,DAG -PKC级联显著激活 ,分别为正常葡萄糖组的 3.4 7倍和 4 .5 4倍 ;在正常血清培养液中 ,与 5 .5mmol/L的葡萄糖相比 ,2 0mmol/L高糖在 2 4h时并不刺激DAG含量增加 (P >0 .0 5 ) ,而 72h时则较对照组增加 4 5 % ,PKC活性较对照增加 5 6 % ,而d -α -生育酚可逆转上述生化改变。结论 :Amadori糖化血清白蛋白可在生理葡萄糖浓度下刺激DAG -PKC途径活化 ,从而影响血管一系列生理功能 ,而d -α-生育酚对血管生化改变有保护作用。

β-catenin介导蛋白激酶D2对脑胶质瘤细胞增殖的影响

目的研究蛋白激酶(PKD2)是否通过β-catenin来调控脑胶质瘤细胞的增殖。方法采用EDU掺入实验观察下调PKD2或β-catenin后U251细胞增殖能力的变化;免疫印迹实验检测下调PKD2后β-catenin总蛋白水平及其在细胞膜、细胞浆及细胞核中的变化。结果与对照组相比,下调PKD2后U251细胞增殖能力降低;β-catenin总蛋白水平无明显变化,但细胞浆β-catenin水平明显增多,细胞核中明显减少,差异有统计学意义(均P<0.01)。与对照组相比,下调β-catenin后,U251细胞增殖能力降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论下调PKD2可能通过抑制β-catenin向细胞核转位而抑制脑胶质瘤细胞的增殖。

蛋白激酶Cα对人正常肝和肝癌细胞周期及G_1期相关调控因子cyclinD1、cyclinE的影响

目的 探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对人正常肝和肝癌细胞周期的作用和对G1 期相关调控因子的影响。 方法 通过细胞转染技术将PKCαcDNA正向插入的真核表达质粒PXJ4 1 PKCα导入正常肝细胞 (L 0 2 ) ,并利用本室已构建的表达反义PKCα的BEL 74 0 2细胞 (HT6 )检测细胞的生长曲线 ,细胞周期以及细胞对G1 期相关调控因子cylinD1和cyclinE的影响。 结果 构建了稳定过表达PKCα的人正常肝细胞模型 (LT3) ,过表达PKCα可促进L 0 2细胞增殖 ,促进细胞由G1 期向S期的过渡 ;cyclinD1和cyclinE的蛋白水平上升 ,反之表达反义PKCα的BEL 74 0 2细胞 (HT6 )增殖被抑制 ,阻抑细胞由G1 期向S期的过渡 ,cyclinD1和cyclinE的蛋白水平下降。 结论 从正反两个方面表明 ,PKCα可通过作用于G1 期相关周期蛋白的水平影响G1 S期的进程。

Compound C抑制腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化后对缺氧预处理的影响及其机制

【目的】探讨Compound C抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化后对缺氧预处理的影响。【方法】筛选合适的Compound C浓度。将细胞分为Compound C组和non-Compound C组,以上两组再各自分为3个亚组:对照组(control);缺氧预处理+缺氧组(Hyp+OGD);单纯缺氧组(OGD);噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性。ATP荧光检测试剂盒测定胞内的ATP水平。Western Blot法测定各组细胞内AMPKα,磷酸化的AMPKα(P-AMPKα),过氧化物酶体增生激活受体-γ共刺激因子-1α(PGC-1α)的蛋白表达水平。【结果】OGD后Compound C组(0.418±0.021)和non-Compound C组(0.640±0.028)相比,细胞活性下降更明显(P<0.01),经预处理后细胞活性均增加(P均<0.05),加入Compound C后,control组细胞活性下降3.5%(P=0.473),OGD组细胞活性下降34.6%(P<0.01),而缺氧预处理后细胞活性下降21.1%(P<0.05)。OGD后Compound C组(0.042±0.001)和non-Compound C组(0.051±0.001)相比,ATP下降更明显(P<0.05),经预处理后ATP水平分别增加了21.5%及28.0%(P均<0.05)。Compound C 3组AMPKα蛋白的表达与non-Compound C对应的3组相比差异无统计学意义(P均>0.05)。OGD后,Compound C组与non-Compound C组细胞P-AMPKα蛋白的表达均明显增加(与各自的对照组比较,P均<0.05)。经预处理后,non-Compound C组P-AMPKα蛋白的表达较单纯OGD组增加(P<0.05),但Compound C组P-AMPKα蛋白的表达与单纯OGD组间的差异无统计学意义(P=0.935)。Compound C组细胞PGC-1α蛋白的表达与non-Compound C组对应的3组比较明显下降(P均<0.05),其中control组下降了68.1%,Hyp+OGD组下降了24.7%,OGD组下降了39.6%,Hyp+OGD及OGD相对于各自control组均上调其表达(P均<0.05),且预处理组的上调更明显(与OGD组比较,P均<0.05)。【结论】Compound C抑制AMPK的激活后,PGC-1α的表达下调,AMPK为缺氧预处理或缺氧处理上调PGC-1α的其中一条途径,抑制其活体P-AMPKα后其他的途径仍然在缺氧预处理中发挥重要的细胞保护作用。

shRNA干扰蛋白激酶D-2基因提高Tca8113对化疗药物的敏感性研究

目的探讨蛋白激酶D(PKD)-2基因沉默对Tca8113细胞增殖、细胞程序性死亡及对化疗药物敏感性的影响。方法构建针对pkd-2基因的shRNA干扰质粒及空载体对照组质粒,建立pkd-2基因沉默的稳定细胞株;采用甲基噻唑基四唑(MTT)方法检测shRNA干扰后细胞株的增殖情况及对化疗药物的半数抑制质量浓度(IC50);采用流式细胞术检测pkd-2基因沉默前后细胞程序性死亡率及对化疗药物的敏感性;采用免疫组化方法检测pkd-2沉默后细胞中P糖蛋白(P-gp)的表达。结果筛选并建立pkd-2基因沉默的稳定细胞株;经shRNA干扰后Tca8113细胞的增殖速度与野生型细胞相比差异无统计学意义,但IC50明显降低;pkd-2沉默后Tca8113细胞程序性死亡率明显上升,且对化疗药物的敏感性显著提高;与野生型对照组Tca8113相比较,shRNA-pkd-2基因沉默的Tca8113经化疗药物诱导后P-gp表达明显下降。结论 shRNA干扰技术特异性沉默Tca8113中的pkd-2基因,促进了肿瘤细胞的程序性死亡,降低对化疗药物的IC50,并明显提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,同时降低了P-gp的表达。

3,4′,5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷对大肠癌细胞系蛋白激酶C的抑制效应

目的研究3,4’,5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷(3,4’,5,-trihydroxystibene-3-β-mono-D-glucoside,THMG)对大肠癌细胞粘附性、浸润力及蛋白激酶C活性的影响;探讨THMG抗转移作用的信号转导机制。方法利用Boyden小室法等细胞生物学技术检测4种大肠癌细胞(HR8348,Hce-8693,HT29,LoVo)在0.4,0.8,1.6和3.2mmol·L^(-1)等浓度THMG作用下的粘附率、浸润力。[γ-^(32)P]ATP掺入法测定蛋白激酶C活性。结果在3.2mmol·L^(-1)浓度时THMG对HR-8348,Hce-8693,HT-29和LoVo粘附抑制率分别为75.7％,69.4％,67.6％和78.8％,浸润抑制率分别为82.7％,85.7％,89.7％和92.7％,且随着浓度加大,粘附和浸润抑制率提高。3.2 mmol·L^(-1)THMG对HR-8348,Hce-8693,HT-29和LoVo的蛋白激酶C活性抑制率分别是35.1％,36.8％,41.5％,49.6％,呈剂量依赖性关系,与对照组比较具有统计学显著性(P<0.001)。粘附性及浸润力抑制程度与蛋白激酶C活性的抑制程度呈显著性相关(P<0.05)。结论 THMG可能通过抑制蛋白激酶C活性对信号转导系统具有调变作用,THMG对信号转导系统的影响可能是抗粘附抗侵袭效应的重要机制之一。

蛋白激酶Cδ参与帕金森大鼠模型中6-OHDA的神经毒性作用

目的研究蛋白激酶Cδ(PKCδ)细胞核转移在帕金森大鼠模型神经元丢失中的病理作用。方法 40只雄性SD大鼠随机分为Sham组(10只)和PD组(30只),立体定位右侧纹状体注射生理盐水或6-OHDA溶液并通过阿朴吗啡(APO)诱导旋转进行模型筛选,免疫组化检测黑质致密部(SNpc)酪氨酸羟化酶(TH)表达情况。采用Western blotting检测PKCδ蛋白表达并通过共聚焦观察PKCδ在细胞核的表达。结果 PD组SNpc部位TH阳性神经元形态发生了病理改变且密度显著下降(P<0.05);Western blotting显示PD组SNpc组织中PKCδ及Cleaved PKCδ的表达较Sham组显著上调(P<0.05);共聚焦显微镜提示PD组SNpc部位PKCδ与细胞核有共定位。结论 PKCδ的酶解激活及细胞核转位可能参与了PD的神经病理发生。

蛋白激酶C、粘附分子CD44变构体在非小细胞性肺癌中定量表达及作用的研究

目的研究蛋白激酶C(PKC)、粘附分子CD44变构体CD44V3-10在非小细胞性肺癌(NSCLC)中定量表达及在肺癌发生及转移中的作用。方法根据放射免疫结合法,用[r-32P]标记的ATP掺入外源性底物测定PKC的活性;应用免疫组织化学Envision二步染色法测定肺癌组织CD44V3-10的表达。结果肺癌组织细胞胞膜及胞浆中PKC活性分别为(4.56±0.27)nmol/(mg·pr/min),(2.01±0.12)nmol/(mg·pr/min),显著高于正常肺组织(P<0.01)。低分化、未分化肺癌的PKC总活性分别为(6.72±0.14)nmol/(mg·pr·/min)、(6.98±0.17)nmol/(mg·pr/min);CD443-10定量表达IOD值分别为(368.2±25.4)、(389.8±24.8),都显著高于高分化、中分化肺癌(P<0.01);有转移肺癌PKC总活性(6.86±0.15)nmol/(mg·pr/min)、CD44V3-10定量表达IOD值(387.6±25.6)都显著高于无转移肺癌(P<0.01)。结论肺癌组织中存在PKC异常活化现象;PKC活化上调了CD44V3-10的表达,共同促进了肺癌的发生及转移。

蛋白激酶C对SDF-1诱导巨噬细胞趋化及血管内皮生长因子转录的调节作用

目的探讨基质细胞衍生因子(SDF-1)对体外培养的大鼠巨噬细胞的趋化作用和对培养的巨噬细胞株U937细胞血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达的作用,以及蛋白激酶C(PKC)对其的影响。方法用Boyden小室法观察人SDF-1对培养的大鼠脾巨噬细胞的趋化效应,以及蛋白激酶C抑制剂氯化白屈菜季铵碱对其趋化反应的影响;用RT-PCR方法观察浓度为100ng/ml的SDF-1作用12h后人U937细胞VEGF的表达以及氯化白屈菜季铵碱对其作用的影响。结果SDF-1对体外培养的大鼠巨噬细胞表现出剂量依赖的趋化作用,100ng/ml时作用最强,趋化细胞数为(398±159)个/视野;不同浓度的氯化白屈菜季铵碱预处理后均能抑制巨噬细胞的趋化反应,10μmol/L时抑制作用最强,SDF-1的趋化细胞数下降至(68±31)个/视野。SDF-1能使U937细胞VEGF的mRNA转录水平提高20%;当氯化白屈菜季铵碱预处理后,此促进效应受到明显抑制,氯化白屈菜季铵碱浓度为10μmol/L时作用最强,仅可检测到微量VEGF。结论SDF-1通过其受体CXCR4实现对巨噬细胞的趋化作用和促VEGF表达的作用,PKC参与调控该过程。

辛伐他汀及oxLDL对人脐静脉内皮细胞蛋白激酶C活性和胞质内游离钙水平的影响

目的 :探讨氧化低密度脂蛋白 (ox L DL)及 3-羟基 - 3甲基戊二酰辅酶 A(HMG- Co A)还原酶抑制剂辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞 (HU VEC)蛋白激酶 C(PKC)活性和胞质内游离钙浓度 ([Ca2 + ]i)的影响。 方法 :HUVEC的 PKC活性采用γ- 32 P- ATP磷酸转移法 ,细胞内游离钙采用 Fluo- 3/ Am荧光负载 ,流式细胞术检测。 结果 :ox L DL呈剂量依赖方式促进 HU -VEC PKC活性增加 ,12 min时达峰值 ,然后缓慢下降 ,30 m in时仍维持较高水平 ;胞质内 [Ca2 + ]i升高分快速相和持续相 2个时相 ;移去细胞外液钙 ,ox L DL仍引起快速相 ,但持续相消失 ;辛伐他汀则能明显抑制 ox L DL引起的 HU VEC PKC活性增加 ,并显著降低持续相胞质内钙水平 ,而对快速相无影响。 结论 :ox L DL能引起 HUVEC内信号通路 PKC及 [Ca2 + ]i的动态变化 ,二者密切相关。 ox L DL刺激 HUVEC [Ca2 + ]i升高的快速相是由胞质钙池释放引起 ,持续相升高主要由胞外钙内流引起。辛伐他汀抑制 HU VEC PKC活性可能是通过胞内 [Ca2 +

蛋白激酶C对大肠癌耐药株LoVo/Adr细胞多药耐药性的影响

目的 探讨蛋白激酶C（PKC）活性对大肠癌多药耐药性的影响以及可能涉及的调控机制。方法 （1）以放射性32P,掺入法检测了在十字孢碱（SP）和佛波脂（PMA）作用下大肠癌耐药细胞LoVo/Adr中PKC活性的变化;（2）以流式细胞术检测了PKC活性对LoVo/Adr细胞摄入阿霉素的影响;（3）以RT-PCR法检测了PKC活性对LoVo/Adr细胞mdr1基因表达的影响。结果（1）PMA可双向调节LoVo/Adr细胞的PKC活性,SP对LoVo/Adr细胞胞浆和胞膜中的PKC活性均有显著的抑制效果;（2）在PMA作用30min时,LoVo/Adr细胞中阿霉素的摄入量显著减少,作用24h时,阿霉素摄入量显著增加;（3）PMA和SP均不影响mdr1基因的表达。结论 PKC可调控细胞的多药耐药性,但并非通过调节mdr1基因的mRNA水平而实现。

蛋白激酶D1对骨髓间充质干细胞中CXCR4的调控作用

目的:探讨蛋白激酶D1(PKD1)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)存活、增殖、迁移和凋亡的影响,并分析PKD1对趋化因子受体4(CXCR4)表达的调控作用.方法:从Wistar大鼠股骨和胫骨中分离并收集BMSCs细胞,体外培养鉴定.实验分为5组:对照组(Control)、氧糖剥夺-复氧组(OGD)、PKD1组、AMD3100(CXCR4的特异性阻断剂)组和AMD3100-PKD1组.CCK-8法检测BMSCs的存活率,Tunel法检测BMSCs的凋亡情况,BrdU法检测BMSCs的增殖能力,Transwell法检测BMSCs的迁移能力,RT-PCR法检测BMSCs中CXCR4的mRNA表达,Western blot法检测CXCR4的蛋白表达.结果:PKD1预处理可明显提升BMSCs的存活、增殖和迁移能力(P<0.05),减少BMSCs的凋亡数量(P<0.05);并上调BMSCs中CXCR4 mRNA和蛋白的表达(P<0.05).阻断剂AMD3100可降低PKD1预处理后BMSCs的存活、增殖和迁移能力,增加BMSCs的凋亡数量,下调BMSCs中CXCR4 mRNA和蛋白的表达,从而减弱PKD1对BMSCs的预处理作用.结论:PKD1可能通过调控CXCR4的表达发挥抗氧糖剥夺-复氧作用:减少BMSCs的凋亡,提高BMSCs的存活、增殖和迁移能力.

DCC基因与蛋白激酶C在大肠癌中的表达及其意义

目的:探讨DCC基因和蛋白激酶C(PKC)在大肠癌组织中的表达及其与临床病理学特征的关系。方法:采用免疫组化EnVision^(TM)法,对30例正常大肠组织和91例大肠癌组织中的DCC蛋白及PKC表达状态进行检测,并将结果与各临床病理因素进行相关的统计分析。结果:30例正常大肠组织中DCC及PKC均为阳性。91例大肠癌中DCC阴性率为43.9％,PKC阴性率为51.6％,两者的表达水平呈正相关(相关系数r=0.041,P=0.005)。其中DCC的表达与肿瘤分化程度、术后有无脏器的转移、5年生存率有统计学相关性(P<0.05),而PKC的表达仅与肿瘤组织分化程度有统计学相关性(P=0.019)。利用Cox回归模型进行单因素和多因素分析,发现只有分期与DCC表达水平可作为大肠癌独立的预后因素。结论:DCC基因与PKC均参与了大肠癌组织学分化的调节,其中DCC基因的表达缺失可以作为判断大肠癌转移潜能及预后的独立指标。

利用γ-^(32)P-ATP、^(51)Cr研究蛋白激酶C对血管内皮细胞CD44表达及内皮粘附功能的影响

利用γ-32P-ATP5、1Cr示踪法研究了蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)对血管内皮细胞CD44分子表达及内皮粘附功能的影响及机制。通过测定外源性底物对γ3-2P-ATP的摄入量确定人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)PKC的活性;以γ-32P-ATP及聚丙烯酰胺凝胶电泳测定CD44分子的磷酸化;用流式细胞仪测定CD44分子的表达;以51Cr标记血小板测定HUVECs的粘附率。结果表明,用PKC激活剂十四酰佛波醇乙酯(Phorbol-myristate-acetate,PMA)作用人HUVECs 30 min,PKC的活性达到最高,CD44的磷酸化达最大,为4 960±136 min-1.μg-1,CD44分子表达及HUVECs的粘附率也达到最高水平;与对照组相比,P均<0.001。这说明PKC能通过磷酸化作用上调CD44分子的表达,并增强内皮细胞的粘附功能。