鸭源PKCI miRNA表达载体的构建及鉴定

为给蛋白激酶C抑制蛋白（PKCI）在鸭肠炎病毒增殖的作用机制奠定基础,根据PKCI基因mRNA序列及miRNA设计原则,合成4对miRNA寡聚单链DNA,退火成双链dsDNA,用载体构建试剂盒进行重组质粒构建,插入miRNA表达载体（pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR）构建表达质粒,转化至感受态细胞DH5α,筛选并提取重组质粒进行测序分析。结果表明：在含壮观霉素的LB平板可生长出含目的基因的重组细菌菌落;测序表明成功构建了鸭源PKCI基因miRNA表达载体,重组质粒pSilencer-PKCI-1～pSilencer-PKCI-4的插入部分大小为71～134bp、68～131bp、68～130bp和68～131bp;重组质粒miRNA有鼠类miR-155骨架结构,即左侧为天然miR-155结构,右边为发卡结构的末端环区（internal loop）和配对区域内部的末端环区miRNA结构。

子宫腺肌病患者子宫结合带组织中OTR、PKCβ、CPI-17表达观察

目的观察子宫腺肌病(AM)患者子宫结合带(JZ)组织中缩宫素受体(OTR)、蛋白激酶Cβ(PKCβ)、蛋白激酶C磷酸酶抑制蛋白17(CPI-17)蛋白及mRNA表达变化,并探讨其意义。方法选择45例行子宫切除术的子宫腺肌病(AM)患者(AM组)及45例因宫颈CINⅡ~Ⅲ或卵巢良性肿瘤行子宫切除的妇科患者(对照组)。两组术中均留取子宫JZ组织。采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测两组JZ区组织中OTR、PKCβ、CPI-17蛋白及mRNA。结果 AM组OTR、PKCβ、CPI-17及磷酸化CPI-17蛋白的阳性表达率分别为77.8%(35/45)、84.4%(38/45)、71.1%(32/45)、82.2%(37/45),对照组分别为17.8%(8/45)、22.2%(10/45)、60.0%(27/45)、20.0%(9/45),AM组OTR、PKCβ、CPI-17及磷酸化CPI-17蛋白的阳性表达率均高于对照组(P均<0.05)。AM组JZ组织中OTR、PKCβmRNA的相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。AM患者JZ区组织中OTR与PKCβ蛋白表达呈正相关(r=0.453,P<0.05),PKCβ蛋白与CPI-17蛋白表达呈正相关(r=0.516,P<0.05)。结论 OTR、PKCβ、CPI-17在AM患者JZ区组织中高表达,三者可能共同参与了AM的发生、发展。

靶向PKCI基因RNAi对DEV增殖的影响

为研究蛋白激酶C抑制蛋白(PKCI)在鸭肠炎病毒增殖的作用机制,根据Gen Bank PKCI基因序列,设计并构建p Silencer-PKCI-l^4,比较后选取抑制效率最高的p Silencer转染DEF细胞,采用荧光显微镜法和FQ-PCR法分析靶向PKCI基因RNA干扰下PKCI基因转录变化。结果显示:p Silencer-PKCI-1~4分别转染DEF细胞,其沉默效率分别为70.01%、66.45%、74.6%和76.02%;p Silencer-PKCI-4转染DEF细胞48 h,对DEV-NP基因转录的沉默效率最高,为64.97%;p Silencer-PKCI-4转染24 h后再感染DEV,在36 h时p Silencer-PKCI-4对DEV-NP基因转录的沉默效率最高,为54.25%;感染DEV 24 h后再转染p Silencer-PKCI-4,再处理72 h时p Silencer-PKCI-4对DEV-NP基因转录的沉默效率最高,为47.83%。本试验结果以期为鸭肠炎病毒核衣壳蛋白的致病机理研究奠定基础,为DEV的防控提供新思路。