蛋白激酶CK2及其抑制剂在肿瘤多药耐药中的研究进展

肿瘤耐药性是临床上化疗失败的主要原因之一。蛋白激酶CK2是一种高度保守、具有广泛生物学活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可磷酸化数百种底物。CK2的激活及过表达在肿瘤发生、发展及耐药过程中起到重要作用,并且CK2通过多种机制和信号通路参与耐药细胞中药物的外排、DNA损伤修复以及药物逃逸反应等,并调控耐药细胞中分子伴侣的活性。本研究主要对蛋白激酶CK2的结构功能及其在肿瘤多药耐药中的作用机制进行综述,并对CK2抑制剂在血液系统肿瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌等多种实体瘤中的应用进行了探讨,为临床上开发新的肿瘤耐药分子标志物以及肿瘤的靶向治疗提供新的思路和治疗方案。

蛋白激酶CK2催化亚基的特性

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在和高度保守的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,由两种有调节作用的CK2β亚基和两种催化亚基CK2α与CK2α组成。而两个催化亚基CK2α和CK2α的氨基酸顺序90%是相同的,所以它们的性质很相似,但却又有各自不同的独特作用和性质。如CK2α对于胚胎发育乃至成活形成起着必要的作用,而CK2α的作用主要体现在大脑及雄性的生殖细胞发育方面。本文将对这两种催化亚基的独特性质进行综述。

DNA依赖蛋白激酶催化亚基与细胞周期蛋白T2相互结合的鉴定

目的鉴定与DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNAPKcs)相互结合的蛋白,以深入探讨其生理功能。方法通过免疫共沉淀获得DNAPKcs的相互结合蛋白复合物,SDSPAGE电泳分离蛋白,肽质指纹分析和Western印迹鉴定蛋白。结果以DNAPKcs抗体进行免疫共沉淀从HeLa细胞中获得DNAPKcs的相互结合蛋白,对部分结合蛋白进行质谱分析和蛋白数据库检索,发现转录延伸因子PTEFb的亚基细胞周期蛋白(cyclin)T2是其中之一。其后,通过Western印迹检测,进一步证实DNAPKcs与cyclinT2相互结合作用。结论首次发现DNAPKcs与cyclinT2的相互结合,提示DNAPKcs参与基因转录调控或转录偶联修复反应的生物学功能。

蛋白激酶CK2天然产物类抑制剂的定量构效关系研究

目的 构建CK2天然产物类抑制剂的定量构效关系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)模型,揭示影响该类抑制剂活性的结构因素,为新型CK2抑制剂的开发提供理论基础和实验依据。方法 基于文献报道的115个多骨架CK2天然产物类抑制剂,采用遗传算法(genetic algorithm,GA)联合多元线性回归(multiple linear regression,MLR)方法,建立了基于优选的Dragon描述符的QSAR模型,以留一法交叉验证系数Q^(2)_(LOO)以及相关系数R^(2)作为模型内部验证的评价指标;通过Q^(2)_(ext)和R^(2)_(ext)评估模型的外部预测能力。结果 最优2D-QSAR模型由8个描述符组成,基于训练集内部验证的统计学参数为Q^(2)_(Loo)=0.7914、R^(2)=0.8220;基于测试集外部验证的统计学参数为Q^(2)_(ext)=0.792 1、R^(2)_(ext)=0.799 8,表明该模型具有较高的可靠性和预测能力。结论 影响CK2天然产物类抑制剂活性的分子描述符包括IVDE、CATS2D_08_DA、nArX、IC1、Chi_D/Dt、SdssC、F08[C-O]以及C-006。本研究可为新型CK2抗癌抑制剂的发现提供实验指导。

重组人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与测序

蛋白激酶ＣＫ２是一种存在的信使非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶．它是由两个催化亚基（α或α′）和两个调节亚基（β）组成的不均一四聚体．用反转录ＰＣＲ从ＨＬ－６０细胞中获得了人蛋白激酶ＣＫ２β亚基编码区ｃＤＮＡ，将ＮｄｅⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切ＰＣＲ产物连接到表达载体ｐＴ７－７的ＮｄｅⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切位点中．转化感受态细菌ＤＨ５α获得转化子，阳性筛选率为７２％．限制性酶切分析结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符．随机挑选４个阳性质粒测定其插入片段ＤＮＡ序列，结果显示有２个含有正确插入的人蛋白激酶ＣＫ２βｃＤＮＡ，命名为ｐＴＣＫＢ．其余２个克隆分别存在１个和２个点突变，即在其编码区ｃｏｎｄｏｎ１４８的ＴＣＡ→ＴＴＡ，结果Ｓｅｒ→Ｌｅｕ；另一个则在Ｃｏｎｄｏｎ１４３ＧＴＧ→ＡＴＧ，Ｖａｌ→Ｍｅｔ；Ｃｏｎｄｏｎ１７０ＧＴＧ→ＧＣＧ，Ｖａｌ→Ａｌａ．重组质粒（ｐＴＣＫＢ）克隆的成功，将为在原核细胞中表达蛋白激酶ＣＫ２β亚基以及利用ＣＫ２βｃＤＮＡ作为探针进行深入研究打下基础．

人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 .

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2

小鼠蛋白激酶CK2α亚基的克隆、测序、表达及初步鉴定

背景与目的:蛋白激酶CK2是一种高度保守性的真核细胞中普遍存在的丝/苏氨酸激酶,它的活性在人的许多肿瘤细胞是升高的,可作为一种癌基因起作用。为了深入进行CK2结构与功能的研究,本研究拟构建小鼠蛋白激酶CK2α亚基cDNA重组表达质粒,并进行表达和初步鉴定。方法:通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞获得小鼠CK2α亚基编码区cDNA。将NdeⅠ/BamHI双酶切PCR产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体pT7-7进行定向克隆。转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子,琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选4个阳性克隆进行DNA测序,将序列完全正确的重组质粒转化表达菌BL21(DE3),挑单克隆小量培养,IPTG诱导表达,Westernblot鉴定。结果:转化子的阳性筛选率为100%;限制性酶切分析结果表明,插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。DNA正反向测序结果表明:从4个阳性克隆中筛选到1个PCR过程不产生突变的重组质粒,并将其质粒命名为pTMCKA。重组质粒转化表达菌经IPTG诱导后出现一分子量42kDa蛋白过度表达,Westernblot结果证明过度表达产物能与抗人CK2α亚基抗体发生特异性免疫反应。结论:重组小鼠蛋白激酶CK2α亚基的克隆表达获得成功。

蛋白激酶CK2β、P16蛋白、人乳头瘤病毒壳蛋白联合检测诊断宫颈癌的临床价值分析

目的:探讨宫颈癌患者采用蛋白激酶CK2β、P16蛋白、人乳头瘤病毒壳蛋白(HPVL-1)联合检测的临床诊断价值。方法:选取2020年6月—2022年1月单县中心医院收治的116例宫颈癌患者作为观察组,选取同时期收治的116例宫颈瘤变患者作为对照组。患者均接受病理、蛋白激酶CK2β、P16蛋白、HPVL-1检查,将临床综合检查结果作为金标准,分析蛋白激酶CK2β、P16蛋白、HPVL-1联合检测诊断宫颈癌的价值。结果:观察组HPVL-1阳性率低于对照组,P16、蛋白激酶CK2β阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。HPVL-1、P16、蛋白激酶CK2β联合检测的灵敏度高于单一检测,漏诊率低于单一检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:蛋白激酶CK2β、P16蛋白、HPVL-1联合检测诊断宫颈癌,灵敏度高,漏诊率低。

小鼠蛋白激酶CK2β亚基的克隆、表达及活性测定

通过反转录PCR从NIH 3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2 β亚基编码区cDNA ;构建其表达质粒并经测序证明其编码小鼠蛋白激酶CK2 β亚基 ,但与两种已报道的小鼠CK2 β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异 ,与大鼠、猪、兔和人CK2 β亚基cDNA的编码区相应碱基序列则一致。将其在表达菌BL2 1(DE3)中诱导表达 ,出现一 2 6kDa分子量蛋白过度表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 31 7%,但大多数以不溶形式存在。Westernblot鉴定表明 :过度表达产物能与抗人CK2 β亚基抗体发生特异性免疫反应。当CK2α和 β亚基以 1:1摩尔比混合时 ,构成性的CK2全酶显示出最大活性 ,直接表明CK2 β亚基对CK2α有激活作用。这些结果有力地证明了克隆表达的重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2

醛缩酶A可与人蛋白激酶CK2α′亚基发生特异相互作用

通过PCR扩增构建的重组质粒pTHCKA′获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将PstⅠ NdeⅠ双酶切的PCR产物 ,连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7,构建为酵母双杂交穿梭表达质粒 (BD质粒 ) ,经DNA测序确证及转染感受态酵母菌AH10 9以排除自主激活 .从体外培养的HL 6 0细胞中提取总RNA ,采用CLONTECHSMART(switchingmechanismat 5′endofRNAtranscript)技术 ,在酵母细胞中构建HL 6 0细胞的酵母双杂交cDNA文库 ,将构建的BD质粒、文库cDNA、酵母穿梭表达质粒pGADT7 Rec ,共转染感受态酵母菌AH10 9进行酵母双杂交实验 .筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白 .筛选结果及一对一回复性实验显示 ,有 6种与CK2α′相互作用蛋白 ,核酸序列分析及同源性检索表明 ,其中 1种与醛缩酶A有高度同源性 (99 6 % ) .

蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析

目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能。方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验。结果通过RT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(ProteinKinase2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α。通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致。结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础。

一种与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白的cDNA序列测定

目的:测定一种与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白的cDNA序列。方法:选择一个与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白的重组质粒pGADT7-LibrarycDNA ,使用BigDyeTM荧光标记终止底物循环测序试剂盒,用载体pGADT7的T7-启动子为测序引物,在ABIPRISM 310型基因分析仪上进行DNA测序。结果:该重组质粒的插入片段与泛素—核糖体蛋白S2 7acDNA序列只有一个碱基的差别。结论:通过DNA测序,该种与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白为泛素—核糖体蛋白S2 7a的变体。

人蛋白激酶CK2α′亚基cDNA的克隆与测序

目的 构建人蛋白激酶CK 2α′亚基cDNA重组表达质粒 ,研究CK 2的结构与功能。方法 采用RT -PCR、定向克隆和DNA测序等一系列分子生物学技术进行本实验。结果 从人白血病细胞 (HL 60 )中获得了人CK 2α′亚基cDNA ,使用NdeⅠ /HindⅢ双酶切PCR产物和表达载体 pT 7-7进行定向克隆 ,限制性酶切鉴定证明重组获得成功。 4个阳性克隆DNA测序结果显示有 1个含有正确插入的人CK 2α′cDNA ,命名为 pTCKA′ ;其余 3个克隆均存在碱基突变。 结论 成功克隆到人CK 2α′亚基cDNA的重组表达质粒。

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

】目的 :构建小鼠蛋白激酶 CK2 β亚基 c DNA重组表达质粒 ,以便深入进行 CK2结构与功能的研究。方法 :通过反转录 PCR从 NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶 CK2 β亚基编码区 c DNA,PCR扩增酶为高保真 DNA聚合酶。将 N de I/ H ind 彻底双酶切 PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去 5′端磷酸的同样彻底 Nde I/ H ind 双酶切的表达载体 p T7- 7中 ,转化感受态大肠杆菌 DH5 α获得转化子 ,用 0 .8%琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子 ,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行 DNA测序。结果 :转化子的阳性筛选率为 10 0 % ,限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。 DNA测序结果表明 :两个重组小鼠 CK2 β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠 CK2 β亚基 c DNA编码区序列分别存在一个碱基差异 ,但我们报道的这 2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人 CK2 β亚基 c DNA的编码区相应碱基序列一致。结论 :本实验克隆的小鼠蛋白激酶 CK2 β亚基 c

人蛋白激酶CK2 β亚基cDNA重组质粒的构建与测序

蛋白激酶ＣＫ２，曾称为酪蛋白激酶Ⅱ或２，是真核细胞中普遍存在的一种ｃＡＭＰ非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶。它是由两个催化亚基（α或α′）和两个调节亚基（β）组成的不均一四聚体。在进化过程中该酶的氨基酸和核苷酸序列保持高度保守性，属于一种看家酶。在代谢过程...

肝癌中蛋白激酶CK_(2α)亚基的克隆及其功能初步研究

目的 克隆肝癌中CK2α基因 ,并研究其功能。方法 通过逆转录PCR从肝癌组织中获得CK2α亚基基因编码区cDNA。将NdeI/BamHI双酶切PCR产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体 pT7- 7进行定向克隆。转化感受态大肠杆菌DH5获得转化子 ,琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子 ,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选 4个阳性克隆进行DNA测序 ,将序列完全正确的重组质粒转化表达菌BL2 1(DE3) ,挑单克隆小量培养 ,IPTG诱导表达 ,Westernblot鉴定。结果 转化子的阳性筛选率为 10 0 % ,限制性酶分析结果表明 ,插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。DNA正反向测序结果表明 :从 4个阳性克隆中筛选到 1个PCR过程不产生突变的重组质粒 ,并将其质粒命名为 pTMCKA。重组质粒转化表达菌经TPTG诱导后出现一个分子量 4 2Kda蛋白过度表达 ,Westernblot结果证明过度表达产物能与抗人CK2α亚基抗体发生特异性免疫反应。结论蛋白激酶CK2α亚基在肝癌中表达 。

针对人蛋白激酶CK2α亚基的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建针对人蛋白激酶CK 2α亚基的shRNA表达质粒。方法:以mU 6pro为载体,化学合成shRNA表达模板,并定向克隆到载体的U 6启动子下游,琼脂糖凝胶电泳法筛选阳性克隆,基因测序法检测插入模板序列的正确性。结果:获得了正确的重组质粒,插入的转录模板序列完全正确。结论:成功构建了针对人蛋白激酶CK 2α亚基的RNA i体系。

运用ABI PRISM 310型基因分析仪测定重组人蛋白激酶CK2 α和β亚基cDNA序列

目的：测定重组质粒中编码人蛋白激酶ＣＫ２α和β亚基ｃＤＮＡ序列，筛选含完全正确插入片段的重组质粒。方法：随机选择人蛋白激酶ＣＫ２α和β重组质粒各四个阳性克隆。使用二氯罗丹明荧光标记终止底物循环测序试剂盒，分别加入首尾正反或／和中段正反引物，运用ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０型基因分析仪进行ＤＮＡ测序。结果：在ＣＫ２α和β阳性克隆中各有两个含完全正确的插入片段的重组质粒，其他各两个重组质粒的插入片段中均存在至少一个碱基突变。２４个测序反应的平均精确度为（９８．７±０．４）％；Ｎ平均出现率为（１．４±０．４）％。