碳黑与镉复合暴露经PERK通路致人支气管上皮细胞自噬与炎症反应

目的探究碳黑与镉(cadmium,Cd)复合暴露对人支气管上皮细胞株16HBE细胞蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)通路的影响,及其所致自噬和炎症反应的作用机制。方法于2022年1月,复苏培养人支气管上皮16HBE细胞。将碳黑纳米颗粒(carbon black nanoparticles,CBNPs)氧化后吸附Cd^(2+)构建CBNPs-Cd复合物。CCK-8试验检测CBNPs与Cd不同浓度和时间组合暴露对16HBE细胞活力的影响。以2μg/ml Cd,100μg/ml CBNPs,100μg/ml CBNPs+2μg/ml Cd联合暴露24 h作为后续剂量分组。分别应用透射电镜检测自噬体和自噬溶酶体数量。蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测PERK通路蛋白PERK、真核翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIf2α)、激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、自噬相关蛋白螯合体1(sequestosome 1,SQSTM1)/P62和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAlPILC3,简称LC3)的表达。以基因沉默技术抑制PERK基因后,检测自噬标志蛋白P62、LC3的变化,使用荧光定量PCR技术检测炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL6)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL8)的表达。多组比较采用单因素方差分析,组内两两之间的比较采用LSD检验;多因素的成分分析采用析因分析。结果CBNPs与Cd单独/复合暴露24 h后,16HBE细胞活力变化均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,CBNPs与Cd单独/复合暴露组16HBE细胞P62和LC3表达均明显升高(P<0.05),且复合暴露组较其他组别的自噬体和自噬溶酶体数量增加。与对照组比较,CBNPs和Cd单独暴露对p-PERK/PERK、p-eIf2α/eIf2α蛋白表达影响均无统计学意义(P>0.05),但复合暴露组p-PERK/PERK、p-eIf2α/eIf2α、ATF4蛋白的表达均升高(P<0.05),且CBNPs与Cd单独/复合暴露组16HBE细胞IL6、IL8水平均明显高于对照组(P<0.05)。CBNPs-Cd复合暴露组敲低PERK基因后,LC3蛋白和IL6、IL8水平均减少(P<0.05)。析因分析结果显示,CBNPs和Cd单独暴露对P62、LC3和IL6的表达发挥明显作用(P<0.05),但两化学物之间交互作用无统计学意义(P>0.05)。结论CBNPs-Cd复合暴露可能通过激活PERK-eIf2α-ATF4通路,致人支气管上皮细胞自噬受阻、炎症反应增加。