蛋白片段互补分析方法及其应用

蛋白片段互补分析技术是近年发展起来的一种分析蛋白质-蛋白质相互作用的新方法。典型的蛋白片段互补分析技术已经成功地利用二氢叶酸还原酶,β-内酰胺酶,绿色荧光蛋白以及荧光素酶片段互补进行胞内蛋白分子相互作用研究。这一技术不仅可以动态、定位分析细胞内蛋白质分子相互作用、绘制细胞内信号传导、蛋白质生物化学网络,还可以应用到蛋白质文库、cDNA文库和高通量药物筛选等。综述了蛋白片段互补分析技术的原理、方法及其应用。

蛋白片段互补分析技术研究进展

基于报告蛋白功能重建的蛋白片段互补分析(protein fragment complementation assay,PCA)技术是研究体内蛋白质相互作用重要方法,可检测和分析蛋白相互作用及其时空变化和调节因素。目前已开发出多种不同报告蛋白的PCA系统,具有灵敏度高、信噪比高、可定量和高通量化、适用范围广等特点。主要对PCA的原理、不同类型及其应用领域等方面进行阐述,并展望其发展前景。

蛋白质/多肽片段互补分析法检测alpha-突触核蛋白在细胞中的聚集

Alpha-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集是引起帕金森病(Parkinson’s disease,PD)发生发展主要原因。本文用蛋白质/多肽片段互补分析法(protein-fragment complementation assays,PCAs)检测α-syn在细胞内的聚集。分别构建融合α-syn与人工改造的荧光素酶human Gaussiaprinceps luciferase(h GLuc)蛋白N端或C端蛋白的质粒,共转入人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,通过检测酶活性来确定野生型(wild type,WT)及A53T突变体α-syn在细胞中的聚集情况。结果表明WT和A53T突变α-syn都能使荧光素酶活性增强,而且与野生型α-syn相比,突变体A53T的荧光素酶活性更强,说明二者都能聚集,而且A53T聚集程度高于WT。PCAs法具有高灵敏度,不仅能检测α-syn在细胞内的聚集,而且能反映其聚集的程度,为研究帕金森病提供了研究思路和相应药物筛选的有效工具。

G蛋白偶联受体高阶聚化和信号转导中蛋白复合体的时空动态检测进展

传统观点认为,G蛋白偶联受体与G蛋白、调节蛋白、GRKs以及arrestins间的相互作用是连续的,其中涉及多个蛋白质之间快速的集合和解聚。而实际上,GPCRs和相关靶分子之间的作用是通过一系列细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的信号转导网络来实现的。近10年,随着一些新兴技术的出现,如FRET、BRET和BiFC,实时动态观测二个蛋白质间相互作用的研究成为热点。最近,一些技术结合的方法为从"时间、空间、动态、连续"检测更多蛋白质之间的相互作用的研究拉开新的帷幕。从横向来看,这些技术的结合可以用来研究细胞膜上3种甚至更多蛋白质的高阶寡聚化;从纵向来看,可以对细胞膜-细胞质-细胞核中所发生的信号转导网络的研究提供新的技术手段,多种技术结合所发挥作用是最近出现的几种技术所无法企及的,这对于疾病发病机制的研究及新的药物靶点的发现具有深远意义。因此,本文就一些技术的结合及其应用做一简要综述。

G蛋白偶联受体寡聚化检测技术——共振能量转移技术和蛋白质片段互补技术

蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interactions,PPIs)在细胞内信号途径的分子机制中具有重要作用,文章叙述了活细胞中以非侵入性荧光和生物发光为基础检测特异性PPIs的方法如FRET、BRET、BiFC和BiLC,上述技术广泛应用于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)寡聚化的研究,单独或联合应用这些新技术是研究两个蛋白或多个蛋白PPIs的最佳方法,文章描述了上述生物技术的最新进展及其优缺点,着重阐述在PPIs方面的应用。

乙型肝炎病毒多聚酶末端蛋白重链可变区抗体体外抑制病毒的复制

目的用蛋白片段互补法（PCA）选择HBV多聚酶末端蛋白（TP）重链可变区（VH）抗体，研究特异性VH抗体体外抑制HBV的复制与分泌。方法以HBV多聚酶TP区为抗原，用PCA法进行特异性VH抗体筛选。特异性VH抗体基因定向亚克隆入真核表达载体pZeoSV2（＋），构建pZeoSV2（＋）-VH重组质粒，用脂质体介导的转染技术，将其导入HepG2．2．15细胞，观察特异性抗体的生物学活性。结果用PCA法从抗体库中选择出3个特异性抗体：VH1、VH2和VH3，其中与抗原亲和力最高的是VH1。转染pZeoSV2（＋）-VH1的HepG2．2．15细胞比未转染pZeoSV2（＋）-VH1或只转染空载体pZeoSV2（＋）的HepG2．2．15细胞病毒颗粒分泌明显减少，上清液内为2．9787±0．2761比5．1504±0．2761和5．2951±0．2410（P〈0．05）；细胞内为5．2839±0．1629比8．3004±0．3232和8．5321±0．1383（P〈0．05）。结论用PCA法可从抗体库中选择出HBV多聚酶TP区特异性VH抗体，该抗体在体外可抑制HBV的复制与分泌。

双分子荧光互补技术的应用与展望

双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子,从而产生荧光。BiFC方法简单直观,具有可视性的特点,对温度敏感,荧光片段种类较多,被广泛地应用到不同的细胞中,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外,BiFC还能在蛋白构型的确定以及RNA的检测方面发挥作用。经过若干年的发展,双色荧光互补技术已经发展成包括多色荧光互补技术,BiFC和FRET联用技术以及BiFC和YTH联用技术在内的多种技术,拓宽了BiFC的应用。