蛋白磷酸酶Ⅰ(PPP1R3)在直肠癌细胞体外侵袭转移的生物学活性研究

目的探讨研究蛋白磷酸酶I(protein phosphatase1 regulatory subunit 3,PPP1R3)在直肠癌SW480细胞中的黏附、运动、迁移和侵袭能力的生物学活性。方法用PPP1R3、EGFR抗体、VEGFR抗体干预SW480细胞后,分别对其行细胞运动实验、黏附实验、迁移及侵袭实验,分析PPP1R3对SW480细胞运动、黏附、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。结果随着PPP1R3浓度的增加,直肠癌SW480细胞的黏附、运动、迁移和侵袭能力明显减退(P<0.05)。而且穿过人工基底膜的能力明显减低(P<0.05)。结论 PPP1R3能够抑制直肠癌SW480体外的侵袭、转移作用,可为PPP1R3基因表达缺失的直肠癌术后患者提供放化疗、生物靶向治疗依据。

Ⅰ型蛋白磷酸酶研究进展

Ⅰ型蛋白磷酸酶(PP1)属丝/苏氨酸磷酸酶的一种,在生物体中广泛存在,参与调节多种重要的生理功能,包括转录、翻译、代谢、细胞生长及分化等。PP1分子结构表面的3个凹槽及β12-β13 Loop环结构,它在底物与抑制剂的结合方面起决定作用。近期研究发现,Loop环结构除了是抑制剂的结合部位之外,对整个酶分子的结构和性质都起重要作用。功能研究也证明PP1还参与HIV-1转录过程的调节,并且与老年性痴呆等多种疾病密切相关。主要对PP1的组织分布、分子结构、酶学特性、催化机制以及生物学功能等方面进行了相应的综述。

弓形虫Ⅰ型蛋白磷酸酶基因的原核表达及蛋白的定位研究

为表达刚地弓形虫Ⅰ型蛋白磷酸酶(Toxoplasma gondii protein phosphatase 1,Tg PP1)基因、确定Tg PP1在弓形虫速殖子上的定位,将全基因合成的Tg PP1基因克隆到表达载体p ET-30a(+)中,构建重组载体p ET30a-Tg PP1,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导,利用SDS-PAGE和Westernblot检测重组蛋白表达情况及其免疫学活性。通过亲和层析获得Tg PP1重组蛋白,制备抗血清,采用间接ELISA检测血清效价、免疫荧光法检测Tg PP1蛋白在弓形虫中的定位。结果显示,成功构建了重组表达载体p ET30a-Tg PP1并实现了在大肠杆菌中的表达,表达产物的分子质量约为36 ku。Western-blot检测结果显示,重组蛋白能与弓形虫感染小鼠阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。免疫荧光检测结果显示,Tg PP1主要定位于弓形虫速殖子顶端。上述结果为进一步研究Tg PP1在弓形虫入侵和繁殖过程中的作用及其机制打下了基础。

pEGFP-N1-PP1α真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

目的构建人PP1α基因真核表达载体,并观察其在人骨肉瘤细胞株(U-2OS)中的表达,为进一步研究PP1对骨肉瘤细胞凋亡影响提供基础。方法提取U-2OS细胞中总RNA,RT-PCR扩增PP1α并克隆至pEGFP-N1载体,鉴定出阳性克隆送测序,以重组质粒转染U-2OS细胞,通过West-ernblot检测转染细胞中PP1α的表达。结果成功扩增PP1α基因大小片段,重组质粒pEGFP-N1-PP1α的酶切鉴定及测序结果均证明PP1α基因成功克隆到真核表达载体中,Westernblot结果证实转染重组质粒后的U-2OS细胞PP1α蛋白表达水平增强。结论实验将pEGFP-N1-PP1α质粒转染到U-2OS细胞,可以在U-2OS细胞中获得PP1α蛋白增强表达。