黑鲷钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)基因克隆及表达差异

钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)为参与细胞内pH及细胞增殖调控的关键因子。用RACE末端PCR方法得到黑鲷CHP2(AsCHP2)基因全长cDNA,并利用生物信息学方法分析该基因的序列特征与同源性;同时利用实时荧光定量PCR方法检测AsCHP2的mRNA在黑鲷整体仔鱼,90d、180d黑鲷,杂交F_(2)(真鲷♂×黑鲷♀)及回交F_(1)(黑鲷♂×杂交F_(1)♀)的脑、心脏、肌肉、肝脏和性腺等组织中的表达。研究结果表明:(1)AsCHP2cDNA序列全长1722bp,5'-非编码区(UTR)长度69bp,3'-UTR长度1069bp,开放阅读框长度为585bp,编码194个氨基酸;其结构域包含2个EF-hand结构及1个核输出信号;其蛋白分子质量为21.87ku,理论等电点为4.89;同源建模获得了CHP2的二级与三维结构。AsCHP2基因的核苷酸序列与其他鱼类的相似性为86%~81%,编码的氨基酸序列与其他鱼类的相似性为80%~72%。邻接系统树显示了黑鲷CHP2氨基酸序列与其他鱼类的进化关系。序列比对与结构分析表明,AsCHP2基因具有典型的CHP2基因结构。(2)AsCHP2的mRNA在黑鲷的仔鱼期(5~35d)及大规格个体的脑、肝脏及肌肉组织中均有表达,在90d个体各组织中的表达量均高于在180d个体各组织中的表达量;在180d黑鲷、杂交F_(2)及回交F_(1)的个体中,基因在脑、肝脏、肌肉及性腺等不同组织中均有表达,且均在心脏中高表达、在性腺中低表达。这些结果显示,CHP2基因在海水鱼类的生长、发育过程中发挥功能。

EF-hand对钙调磷酸酶B同源蛋白2的生物学功能影响

目的探讨EF-hand结构对钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)的生物学功能的影响。方法通过PCR扩增CHP2 cDNA片段,构建带GFP标签的野生型及EF-hand突变型CHP2表达质粒;与钠氢离子交换蛋白1(NHE1)共转染PS120细胞;采用激光共聚焦显微镜、膜滤过法、免疫共沉淀等手段,明确CHP2结合Ca2+的数量、部位,以及对CHP2与NHE1结合的影响;在血清饥饿条件下,观察表达EF-hand突变的CHP2(NHE1/CHP2-EF3m/4m)对细胞生存的影响。结果分别突变EF-hand结构EF3或EF4,CHP2结合Ca2+减少;同时突变EF3和EF4,CHP2不能结合Ca2+;免疫共沉淀实验结果显示乙二胺四乙酸(EDTA)剥夺CHP2携带的Ca2+之后,CHP2与NHE1结合的数量明显减少;不携带Ca2+的CHP2在细胞内与NHE1结合的数量也明显减少;在血清饥饿条件下,表达不携带Ca2+的CHP2的细胞存活数量减少。结论 CHP2能结合2个Ca2+,结合部位在EF3和EF4;携带Ca2+能增强CHP2与NHE1的结合能力;在血清饥饿条件下,携带Ca2+的CHP2能提升细胞抵抗死亡的能力。

敲降钙调磷酸酶B同源蛋白2表达导致静脉血管内皮细胞增殖迁移抑制和细胞周期停滞的研究

目的探索钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)表达降低对静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响及其可能机制。方法通过使用靶向CHP2的si RNA降低CHP2在人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中的表达,CCK-8法和流式细胞仪检测CHP2表达降低对细胞增殖和细胞周期的影响,划痕实验和Transwell实验检测CHP2对细胞迁移的作用,Western blot法检测CHP2敲降对活化T细胞核因子(NFAT)入核的影响。结果 CHP2表达降低有效抑制HUVEC细胞增殖,与G0/G1细胞周期停滞相关,CHP2敲降也抑制了HUVEC细胞迁移,机制研究表明CHP2表达降低对细胞增殖和迁移的影响可能与其抑制NFAT入核相关。结论 CHP2的表达降低抑制了静脉血管内皮细胞增殖和迁移,这可能导致静脉血管缺损修复的抑制。

二苯乙烯苷对冈田酸诱导的NG108-15细胞tau蛋白磷酸化的干预作用

目的观察二苯乙烯苷(TSG)对冈田酸诱导的NG108-15细胞增殖及磷酸激酶PP2A、PP2B、PP5和tau蛋白磷酸化的影响,探讨其抗老年痴呆的作用机制。方法采用MTT法观察TSG作用于冈田酸诱导的NG108-15细胞24h的增殖情况。取对数生长期的NG108-15细胞,将其分为正常组,模型组,以及TSG低、中、高剂量(50nmol·L^(-1)、100nmol·L^(-1)、200nmol·L^(-1))组。利用AO/EB双荧光染色法检测TSG对细胞凋亡的影响;蛋白质免疫印迹法(Western Immunoblotting)检测PP2A、PP2B、PP5、tau和P-tau的表达。qRT-PCR法检测PP2A、PP2BmRNA的变化。免疫荧光(immunofluorescence)检测PP2A、PP2B和tau蛋白表达和分布。结果 TSG能够增强冈田酸诱导的NG108-15细胞的增殖能力,呈一定的剂量依赖;与模型组比较,TSG能抑制冈田酸对NG108-15细胞的衰老。TSG能提高PP2A、PP2B、PP5蛋白和降低P-tau蛋白的表达;此外,还能提高PP2A、PP2BmRNA的转录水平。结论二苯乙烯苷能提高NG108-15细胞的抗衰老能力,降低tau蛋白的异常磷酸化,其机制可能是与参与下调tau蛋白磷酸化的磷酸酶有关。

钙调磷酸酶B同源蛋白2核定位对宫颈癌HeLa细胞增殖能力的影响

目的研究钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)在细胞核内定位对人宫颈癌HeLa细胞增殖能力的影响。方法将CHP2核输出信号序列(NES)突变,转染HeLa细胞,从而使CHP2定位在细胞核内,采用MTT法检测HeLa细胞的细胞活力的改变;利用软琼脂集落形成实验观察HeLa细胞集落形成大小和数量的变化;通过体内实验观察HeLa细胞在小鼠体内的成瘤能力。结果荧光共聚焦显微镜显示突变型CHP2(CHP2-NESm)主要定位在HeLa细胞的细胞核内和细胞质,而野生型的CHP2主要定位于细胞质;MTT法结果表明转染CHP2-NESm的HeLa细胞的活力显著强于转染野生型CHP2和空载体的细胞;软琼脂集落形成实验结果表明,转染CHP2-NESm的HeLa细胞的集落数量和集落大小均明显大于转染野生型CHP2和空载体的细胞(P<0.05);体内实验结果显示,转染CHP2-NESm的HeLa细胞较转染野生型CHP2的细胞的成瘤能力增强(P<0.05)。结论 CHP2细胞核内的定位对调控HeLa细胞的增殖能力发挥重要的作用。

钙调磷酸酶B同源蛋白2在胃癌恶性表型中的作用及其意义

目的:观察钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)在临床胃癌组织中的表达和恶性表型作用并分析其临床意义。方法:应用临床胃癌组织芯片(297例胃癌和198例对照良性胃黏膜组织),均来自南通大学附属医院生物样本库。经免疫组织化学法检测胃癌组织中CHP2蛋白表达水平,统计分析CHP2蛋白表达水平与胃癌患者临床特征及预后的关系。在胃癌细胞系中分别进行CHP2抑制和过表达细胞学实验,用细胞划痕实验、Transwell实验和CCK-8法检测胃癌细胞恶性表型变化。结果:CHP2蛋白在胃癌组织中高表达(204/297,68.7%),高于非癌的手术切缘组织(31/91,34.1%)、慢性胃炎组织(13/22,59.1%)、肠化胃黏膜组织(13/38,34.2%)、低级别上皮内瘤变胃黏膜组织(12/30,40.0%)以及高级别上皮内瘤变胃黏膜组织(7/17,41.2%)。胃癌组织中CHP2蛋白高表达与胃癌有转移、TNM分期晚有关( P<0.05),多因素分析显示,CHP2蛋白高表达,TNM分期是胃癌患者预后的独立指标( P<0.05)。胃癌细胞HGC-27在下调CHP2表达后,增殖、迁移能力下降( P<0.05);胃癌细胞AGS在上调CHP2表达后,增殖、迁移能力增强( P<0.05)。 结论:在胃癌发展中,CHP2起到促进增殖和转移作用,可以作为胃癌患者预后的分子标志物以及靶向治疗的潜在靶点。

在血清饥饿条件下CHP2调节NHE1活性减少细胞死亡

钠氢离子交换蛋白(NHE)是维持细胞内pH值等内环境稳定的重要蛋白;钙调磷酸酶B同源蛋白(CHP)是NHE的一个活性调节亚单位。研究CHP2对NHE1的调节作用时发现,在血清饥饿的条件下,PS120细胞依赖于CHP2的表达来调节外源性NHE1的活性,使细胞维持必要的钠氢交换生理活性和较高水平的细胞内pH值(pHi7.4),明显减少细胞因自身的胞浆酸性化而死亡,延长细胞存活时间(70%以上的细胞存活时间超过7天)。实验结果提示,通过研究减少CHP2表达或抑制其活性,可望找到加速细胞死亡的新方法。

miR-141表达抑制增强结肠癌细胞对5-Fu药物敏感性的研究

目的建立人结肠癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药细胞株,并探讨miR-141靶向作用PPP2R1B介导结肠癌细胞对5-Fu耐药的机制。方法通过药物敏感性实验,选取5-Fu敏感细胞COLO-320细胞株采取大剂量冲击联合剂量递增法,诱导筛选5-Fu耐药结肠癌细胞株,稳定传代。四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测耐药细胞和亲本细胞的半数抑制浓度(IC_(50))。PCR的微阵列技术比较亲本细胞和5-Fu耐药细胞差异表达的miRNA分子,从中筛选出1个差异表达的miR-141分子。利用数据库Targetscan和miRBase database预测miR-141的靶基因为PPP2R1B,利用双荧光素酶报告基因检测进行鉴定。基因敲除miR-141后分析miR-141对PPP2R1B的调控作用。结果 COLO-320细胞株经大剂量冲击联合剂量递增的方法诱导后可在5.0μmol/L的5-Fu培养液中稳定增殖,具有耐药性,命名为COLO-320/5-Fu,该细胞株5-Fu的IC_(50)显著高于亲代细胞(P<0.05)。芯片结果显示共有13个miRNAs在耐药细胞株中差异性表达,其中miRNA-141表达增加最为显著(P<0.05)。敲除该miR-141后,耐药细胞的5-Fu敏感性显著增加,凋亡比例增加(P<0.05)。结果显示,PPP2R1B为miR-141的靶基因,miRNA-141表达抑制显著上调PPP2R1B的表达水平并进而影响Akt磷酸化过程。结论本实验成功构建COLO-320/5-Fu耐药细胞株,miR-141可能通过靶向调控PPP2R1B,进而参与调控结肠癌细胞对5-Fu的耐药。