拟南芥CaM5的不同剪接产物对其蛋白质结合活性的影响

钙离子(Ca^(2+))/钙调素(calmodulin, CaM)信号参与植物生长发育和对外界刺激响应的调节。拟南芥(Arabidopsis thaliana)CaM家族共有7个基因,编码的蛋白质氨基酸序列具有高度保守性。该研究通过酵母双杂交及生物信息学分析等方法,对CaM5的2个剪接体CaM5.1和CaM5.3进行蛋白结合活性分析。结果表明,拟南芥钙调素结合蛋白(calmodulin-binding protein,CaMBP)IQM3(IQ motif-containing protein 3)能在酵母中与除CaM5.3外的CaM家族的成员结合。生物信息学分析表明,CaM5.3比CaM5.1和其他CaM亚型成员多出1个由35个氨基酸残基组成的C-末端序列(C-terminal domain,CTD),可能影响CaM5.3与IQM3结合。在CaM5.1的C-末端添加CML10的CTD,将重组蛋白与IQM3进行结合,证实CaM5.3的CTD是影响其与IQM3结合的关键序列。因此,拟南芥CaM5的不同剪接方式影响其蛋白结合活性,为研究钙调素及钙调素结合蛋白的结合活性提供参考。

哮喘大鼠肺表面活性物质结合蛋白A的变化及其意义

目的 :探讨哮喘大鼠肺表面活性物质结合蛋白 A(SP- A)的变化及其在哮喘发病中的意义。方法 :2 6只 Wistar大鼠随机分为正常对照组及哮喘组。卵白蛋白致敏、激发建立大鼠哮喘模型 ,激发哮喘后 ,行支气管肺泡灌洗 ,Western印迹法测定支气管肺泡灌洗液 (BAL F)中 SP- A含量 ;免疫组化方法观察肺组织及气道中 SP- A的变化 ;测定 BAL F中总磷脂 (TPL)、饱和磷脂 (DSPC)和总蛋白质 (TP)含量 ;膜天平测量 BAL F中 PS表面活性。结果 :Western印迹检测显示哮喘组 BAL F中 SP-A含量较对照组明显减少 (P<0 .0 0 1) ;SP- A免疫组化检测结果显示哮喘组大鼠肺及细支气管 SP- A表达明显减弱 (P<0 .0 1) ;哮喘组 BAL F中 TPL及 DSPC含量与对照组无明显差异 ,TP含量显著增加 (P<0 .0 5 ) ;哮喘组 BAL F中 PS表面活性较对照组明显降低 (P<0 .0 0 1) ,BAL F中 PS表面活性与 DSPC及 SP- A含量呈显著正相关 (r=0 .72 5 ,r=0 .95 6 ,P<0 .0 1) ,与 TP含量呈显著负相关 (r=- 0 .6 5 4 ,P<0 .0 1)。 结论 :哮喘大鼠 SP- A表达明显下降 ,SP- A下降可使哮喘时 PS活性更易被血浆蛋白抑制 ,表面活性降低。

血管活性肠肽对肺表面活性物质结合蛋白A表达的影响

目的 :研究血管活性肠肽 (VIP)对肺表面活性物质结合蛋白A(SP A)表达的影响以及VIP调控SP A表达的细胞内信号转导途径。方法 :运用免疫组织化学和RT PCR技术研究VIP对SP A表达的影响 ;并进一步运用受体拮抗、蛋白激酶抑制、反义寡核苷酸阻断等手段探讨VIP促进SP A表达的信号转导途径。结果 :①VIP(10 -8mol/L)促进肺泡Ⅱ型细胞 (ATⅡ )细胞中的SP A蛋白表达和提高肺组织SP AmRNA含量 :②VIP受体拮抗剂 (10 -6mol/L)可取消VIP(10 -8mol/L)促进SP A表达的效应 ;③蛋白激酶C抑制剂H7(10 -5mol/L)和c fos基因的反义寡核苷酸 (9× 10 -6mol/L)均可阻断VIP促进SP A表达的作用。结论 :VIP通过其受体促进SP A的表达 ,PKC及c fos蛋白在介导VIP促进SP A表达的细胞内信号转导过程中起重要作用。

盐酸氨溴索对放射性肺炎患者血清肺表面活性物质结合蛋白-A、D的影响

目的观察盐酸氨溴索对放射性肺炎患者血清肺表面活性物质结合蛋白-A、D(SP-A、SP-D)的影响。方法选择140例胸部恶性肿瘤接受放射治疗后出现放射性肺炎患者,随机分为对照组与观察组,各组均70例患者。对照组:给予放射性肺炎常规治疗,观察组:基础治疗同对照组,另给予盐酸氨溴索雾化吸入。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者治疗前、治疗3、6周后血清SP-A、SP-D及血清炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化。结果两组治疗3、6周后血清SP-A、SP-D水平较治疗前逐渐升高,但观察组治疗后血清SP-A、SP-D水平升高幅度低于对照组(P<0.05);治疗后3周、6周,两组患者血清TNF-α水平均有降低(P<0.05),且观察组血清TNF-α较对照组下降更显著,差异有统计学意义(P<0.05)。结论盐酸氨溴索雾化吸入能够有效促进肺泡-毛细血管屏障的修复,降低恶性肿瘤放射性肺炎患者血清SP-A、SP-D及炎性因子TNF-α的水平。

maltosyl-agarose亲和层析法提取人肺灌洗液中肺表面活性物质结合蛋白A及其鉴定

目的:提取及纯化人肺灌洗液中肺表面活性物质结合蛋白A(SP-A)。方法:由支气管肺泡灌洗液经10000g离心40min获得的沉淀中提取SP-A。沉淀溶解于6M的尿素,SP-A蛋白重新复性后上清过maltosyl-agarose柱进行亲和层析,用梯度EDTA洗脱SP-A,并过surpose6柱纯化。聚丙烯酰胺电泳和Westernblotting鉴定。结果:经亲和层析法可以从人肺灌洗液中提取出高纯度的SP-A,聚丙烯酰胺电泳在36ku和70ku处可见清晰条带,在分子量118ku以上亦可看到3条清晰条带,经Westernblotting鉴定均为特异性SP-A蛋白。结论:采用maltosyl-agarose亲和层析法可以从肺灌洗液中获得高纯度的SP-A。为进一步研究SP-A的功能和制备SP-A单克隆抗体提供了充足的SP-A来源。

肺表面活性物质结合蛋白A研究进展

SP A是肺表面活性物质的重要蛋白成分 ,在维持PS内环境稳定和机体免疫方面发挥重要作用。最近研究表明 ,肺表面活性物质磷脂和SP A也存在于肺泡外肺组织及身体其它器官。就SP A受体、SP A基因表达调控、不同疾病时SP A水平变化及其在肺泡外组织中的分布与功能方面的相关研究进展作一简要综述。

血管内皮生长因子对早产鼠肺泡表面活性物质结合蛋白B的影响

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)对早产鼠肺泡Ⅱ型细胞(AECⅡ)发育和肺泡表面活性物质结合蛋白B(SP-B)表达的影响。方法孕19d Wistar大鼠剖腹取胎鼠,原代培养AECⅡ,分成VEGF-165组、地塞米松组、VEGF加地塞米松组和对照组,检测各组AECⅡ和SP-B表达。结果VEGF-165组、地塞米松组与VEGF加地塞米松组SP-B阳性表达,对照组阴性表达。结论VEGF-165能促进早产鼠肺泡细胞SP-B表达与分泌,可促进肺发育和肺成熟。

脓毒症性ARDS大鼠肺泡表面活性物质结合蛋白的变化及乌司他丁的干预效果

目的:观察乌司他丁注射液干预前后盲肠结扎穿孔法(CLP)致脓毒症性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺泡表面活性物质的改变,探讨表面活性物质在CLP致ARDS发生中的作用以及乌司他丁对其影响。方法:健康成年SD大鼠90只,体质量200~240 g,随机分为3组:假手术对照组(Sham组,n=30)、脓毒症组(CLP组,n=30)和乌司他丁组(UST组,n=30)。利用CLP法建立大鼠脓毒症模型。测定各组大鼠造模后6、12、24、48 h四个时间点肺湿/干质量比(肺水肿指数);使用苏木精-伊红(HE)染色方法和透射电镜对肺组织进行病理观察及急性肺损伤病理评分;通过实时荧光定量核酸扩增技术(RT-PCR)和免疫印迹试验(WB)分别检测肺泡表面活性物质结合蛋白B(SP-B)和肺泡表面活性物质结合蛋白C(SP-C)在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况。结果:与对照组相比,肺水肿指数和肺损伤病理评分显示乌司他丁组大鼠肺损伤明显减轻(P<0.05);乌司他丁组大鼠肺组织中SP-B和SP-C在mRNA水平和蛋白质水平的表达都较CLP组明显升高(P<0.01)。结论:乌司他丁可以提高脓毒症性ARDS大鼠肺泡表面活性物质结合蛋白含量,有效减轻肺损伤。

慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者肺表面活性物质结合蛋白-D和降钙素原与肺功能的相关性分析

目的探讨慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者肺表面活性物质结合蛋白-D(SP-D)、降钙素原(PCT)与肺功能的相关性。方法选取南通大学附属医院2015年2月—2016年2月收治的AECOPD患者64例为AECOPD组,另选取同期慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期患者32例为COPD稳定组,及健康体检人员20例为对照组。检测比较患者肺功能指标,并分析AECOPD不同分级患者与血清SP-D、PCT浓度的相关性。结果治疗前,AECOPD组、COPD稳定组患者第1秒用力呼气末容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)低于对照组,SP-D、PCT高于对照组(P<0.05);AECOPD组患者FEV1/FVC低于COPD稳定组,PCT高于COPD稳定组(P<0.05)。SP-D、PCT水平与肺功能损伤程度呈正相关(P<0.05)。结论 AECOPD患者血清SP-D、PCT水平监测可有效提示疾病进展,实现肺功能损伤程度的动态观察。

肺泡外肺表面活性物质结合蛋白A研究进展

肺表面活性物质结合蛋白A(SP A)是肺表面活性物质中最主要的蛋白成分 ,主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞及clara细胞分泌。研究发现 ,在肺泡外也存在相对低水平的SP A ,在传导气道、中耳、咽鼓管、鼻旁窦、胃肠道、生殖道、胸腺、脾脏、间皮及滑膜细胞内均可检测到SP AmRNA及蛋白 ,SP A可与病原及巨噬细胞结合 ,增强巨噬细胞吞噬杀灭病原 ,这些部位的SP A可能与宿主防御有关 。

重组绵羊肺表面活性物质结合蛋白A的体外生物学活性检测

旨在研究重组绵羊肺表面活性物质结合蛋白A(rSP-A)对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性及淋巴细胞体外增殖的影响,初步分析rSP-A的抑菌活性。使用绵羊肺炎支原体(Mo)感染体外培养的绵羊外周血中性粒细胞以刺激其释放NE,然后应用底物显色法对比分析不同浓度rSP-A对NE活性的影响;使用MTT比色法测定rSP-A对体外培养的绵羊外周血淋巴细胞增殖活性的影响;使用酸化法和平板菌落计数法测定rSP-A对Mo代谢与增殖的影响;应用平板菌落计数法对rSP-A的抑菌活性进行初步分析。NE活性检测结果表明,rSP-A可显著增强Mo刺激绵羊外周血中性粒细胞释放的NE活性(P<0.05),且呈剂量效应关系;淋巴细胞增殖试验显示,rSP-A能够显著抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05);代谢试验证实rSP-A对体外培养的Mo的代谢具有明显的抑制作用(P<0.01);抑菌试验显示,rSP-A对致病性肺炎链球菌和巴氏杆菌的增殖具有明显的抑制作用(P<0.05)。研究结果说明,真核表达的rSP-A具有明显的生物学活性,这为进一步研究绵羊体内肺表面活性物质结合蛋白A(SP-A)的生物学特性奠定了基础。

靶向蜕皮激素受体的新型4,5,6,7-四氢-2H-吲唑酰肼类衍生物的设计、合成及杀虫活性

为了发现结构新颖的昆虫生长调节剂,以蜕皮激素受体(EcR)为靶标,以课题组发现的高活性化合物C(N-(4-(叔丁基)苯基)-2-苯基-2,4,5,6,7,8-六氢环庚基[C]吡唑-3-甲酰胺)为先导化合物,利用活性亚结构拼接的方法,设计合成了25个未见文献报道的新型4,5,6,7-四氢-2H-吲唑酰肼类衍生物,其结构经过核磁共振氢谱、碳谱和高分辨质谱确证。分子对接结果表明,所有目标化合物与EcR具有较好的结合力,其中化合物I-15可以很好地结合到EcR的活性位点,其结合模式和虫酰肼相似;靶标蛋白结合实验证明,I-15在40 mg/L下与EcR具有较好的结合活性(75.8%±7.2%)。初步杀虫活性测定结果表明,部分目标化合物在500 mg/L下对鳞翅目害虫小菜蛾表现出一定的杀虫活性,但总体活性均不如虫酰肼和先导化合物C;进一步分析发现,目标化合物的脂水分配系数(ClogP)普遍低于先导化合物和对照药剂虫酰肼,推测是由于目标化合物的亲脂性较差,从而影响其穿透昆虫表皮的能力,导致杀虫活性较弱。该研究对后续化合物的结构优化具有重要参考价值。

新型2-烷氧基取代苯甲酸香叶酯类蚜虫报警信息素类似物的设计、合成及生物活性

为了发现结构新颖的蚜虫行为控制剂,以课题组发现的高活性化合物3e(2-羟基-3-甲氧基苯甲酸香叶酯)为先导,利用活性亚结构拼接的方法,设计合成了15个未见文献报道的新型2-烷氧基取代苯甲酸香叶酯类蚜虫报警信息素(E)-β-farnesene(EβF)衍生物,其结构经过核磁共振氢谱(^(1)H NMR)、红外光谱(IR)和高分辨质谱(HRMS)的确证。蚜虫驱避活性测定结果表明,部分目标化合物在5μg剂量下对豌豆蚜Acyrthosiphon pisum表现出不同程度的驱避活性,其中化合物6i活性最高,驱避率达到60.9%,与先导化合物3e的活性没有显著性差异。靶标蛋白结合实验证明,部分目标化合物与气味结合蛋白ApisOBP9具有较好的结合活性,尤其是化合物6i与ApisOBP9的结合常数达到(4.92±0.18)μmol/L。进一步的分子对接结果表明,6i与靶标ApisOBP9具有较好的结合作用力,能很好地结合到靶标蛋白的活性位点,其结合模式和先导化合物相似。本研究对后续化合物的结构优化具有重要参考价值。

肺表面活性物质结合蛋白基因的克隆

从正常人肺组织抽提总ＲＮＡ，通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，扩增出肺表面活性物质结合蛋白（ＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃ）基因片段，分别为２４０ｂｐ、１１０ｂｐ。又通过ＰＣＲ产物的回收、克隆、连接、转化、酶解以及ＤＮＡ序列分析，证明所克隆的基因片段与已发表的人成熟ＳＰ－Ｂ、Ｃ的ｃＤＮＡ序列完全一致，未发现有任何突变。提示本研究为利用基因工程手段得到ＳＰ及其与人工合成磷脂重组成有效的外源性肺表面活性物质奠定了基础，同时也证明ＲＴ－ＰＣＲ技术是很有效的ｃＤＮＡ克隆化手段，具有简便快捷的优点。

N-乙酰半胱氨酸对吸入性损伤肺表面活性物质结合蛋白A的影响

目的 探讨N -乙酰半胱氨酸 (NAC)对烟雾吸入性损伤肺表面活性物质结合蛋白A(SPA)表达及功能活性的影响。 方法 采用烟雾吸入性损伤的大鼠模型 ,观察NAC治疗后SPAmRNA表达情况 ,并检测静态肺顺应性、肺泡灌洗液表面张力及Ⅱ型细胞板层体形态。 结果 经NAC治疗后SPAmRNA表达增强 ,静态肺顺应性增加 ,肺泡灌洗液表面张力特征恢复正常 ,Ⅱ型细胞板层体恢复至正常形态。 结论 NAC治疗可促进烟雾吸入伤后SPAmRNA表达 。

血管内皮生长因子与地塞米松对早产鼠肺泡表面活性物质结合蛋白B表达的影响

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)以及地塞米松单独或联合应用对早产大鼠肺泡表面活性物质结合蛋白B(SP-B)mRNA表达的影响,及与肺发育的关系,为临床防治早产儿呼吸窘迫综合征(NRDS)提供新途径。方法:孕15d清洁级Wistar大鼠12只,随机分为4组,每组平均3只,试验分组:VEGF组、地塞米松组、VEGF加地塞米松组和对照组进行试验,应用RT-PCR检测早产鼠肺组织中SP-BmRNA的表达。结果:地塞米松组、VEGF加地塞米松组肺组织中SP-BmRNA表达与对照组比较,P<0.05,差异有显著性,VEGF加地塞米松组较地塞米松组SP-BmRNA表达进一步增加(P<0.05),而VEGF单独应用组与对照组比较,P>0.05,差异无显著性。结论:地塞米松能促进肺表面活性物质的合成和分泌,VEGF能协同地塞米松促进肺表面活性蛋白的分泌与合成。

骨纤维结构不良临床特征及基因突变检测

目的分析骨纤维结构不良(fibrous dysplasia of bone,FD)临床特征,鸟苷酸结合蛋白活性刺激肽(guanine nucleotide-binding proteinα-stimulating activity polypeptide,GNAS)基因突变检测结果。方法回顾性分析上海市第六人民医院骨质疏松和骨病科及骨科2008-2013年诊治的42例FD患者的临床资料,其中28例行GNAS基因检测。结果 42例患者中男22例,女20例;发病年龄1~75岁,平均发病年龄(26.6±17.4)岁。就诊时主诉病变局部骨痛16例,局部肿胀畸形10例,病理性骨折14例,伴皮肤牛奶咖啡斑9例;共累及全身骨骼119块,其中发生于长骨75块(63.0%),以股骨最常受累(25.2%)。34例患者行血常规、肝肾功能、血钙磷检查,其中18例(52.9%)血碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平高于正常参考值,4例(11.8%)血磷降低;13例行甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)检测,3例(23.1%)高于正常值;1例患者伴有甲状旁腺功能亢进。X线及CT表现为病灶部位呈囊状膨胀性、磨玻璃样、增生硬化型、混合性改变;骨核素显像(ECT)显示特征性放射性浓集。28例行GNAS基因2个热点突变位点检测,均未发现突变。结论 FD好发于青少年,多伴有骨痛、骨折、畸形,股骨最常累及,部分患者并发内分泌功能紊乱以及皮肤牛奶咖啡斑。结合X线表现、血ALP等骨转换指标检查和病变组织病理检查有助于FD诊断。基因组DNA检测发现GNAS基因突变阳性可协助FD病因学诊断,但外周血检出基因组DNA突变阳性率低。

丹参酮ⅡA对局灶性脑缺血大鼠急性期脑保护作用的相关研究

目的探讨丹参酮ⅡA(TashinoneⅡA,TSA)对局灶性脑缺血急性期大鼠顶叶皮质磷酸化环腺苷酸反应元件结合蛋白(phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element binding protein,p-CREB)和CREB1活性调节转导子(transducers of regulated CREB1,TORC1)的蛋白表达和脑梗死体积的影响。方法采用成年健康雄性SD大鼠,随机分为假手术组、对照组、小剂量TSA组和大剂量TSA组,每组各12只。用线栓法制作右侧大脑中动脉闭塞模型,采用Longa评分判断动物模型成功与否。小剂量TSA组和大剂量TSA组在造模后立刻腹腔注射TSA溶液,剂量分别为:10 mg/kg及20 mg/kg,假手术组及对照组分别腹腔注射等量的生理盐水。造模成功后24 h将大鼠处死,采用2%2,3,5-三苯基四唑氮红染色计算梗死体积,应用Western blotting法检测各组手术侧顶叶皮质梗死灶神经细胞核TORC1和细胞核p-CREB以及细胞TORC1的蛋白表达。结果与对照组相比,大剂量TSA组大鼠脑组织梗死体积明显降低(P=0.004),细胞核TORC1表达显著增加(P<0.001);与对照组相比,小剂量TSA组大鼠脑组织梗死体积减小,无显著差异(P=0.148),细胞核TORC1蛋白表达升高,也无显著差异(P=0.083),细胞核p-CREB和细胞TORC1的蛋白表达水平无论在大剂量组(P均<0.001),还是小剂量组(P分别为0.002和0.001)均显著升高。结论 TSA可以上调脑梗死大鼠病灶侧顶叶皮质神经细胞TORC1-CREB信号通路的表达。